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【研发速递】外泌体载药研发新突破-小RNA的新武器

活动品牌:和元生物|siRNA | 有效期:2022.04.29-2022.04.29


外泌体(Exosomes)是细胞分泌到胞外的一种囊泡,大小为30-150nm,携带了各种核酸、蛋白质和脂类等物质,可以在不同细胞间进行传递和交流,从而影响受体细胞的生物学功能。

外泌体在大小和功能上与合成的纳米颗粒类似,但作为天然内源性载体,具有免疫原性低、毒性低、稳定性高、渗透性好等优势,故可能成为更有应用前景的药物递送载体。目前,外泌体已经成功运载基因类药物、抗癌药物和抗炎症药物等其他类型药物。


近年来,外泌体作为基因载体引起了基因治疗研究者的广泛关注。与传统的病毒或非病毒载体相比,外泌体作为基因载体其优势包括以下几点:

安全:从患者体内获取的外泌体,经载入基因后,再注入患者体内几乎不会引起免疫反应,更加安全;
保护性强:外泌体粒径较小,可以逃过网状内皮系统的捕捉,有效保护承载的基因;
运载效率高:外泌体可以通过与受体细胞膜融合的方式,将基因类药物释放到细胞质中。


近期,和元生物研发团队展示了他们在外泌体载药上的研发进展,分别用电转法和共孵育法做了miRNA和siRNA两部分装载的探索。根据数据结果显示,相比共孵育法,电转法能更有效地将miRNA和siRNA这些小RNA载入到外泌体中,这为后续验证miRNA和siRNA对体内外功能的影响奠定了基础。下面具体介绍实验过程和结果。

外泌体载药之miRNA装载篇

图一 外泌体miRNA装载及检测示意图


1.实验结果:


1)外泌体超离后,根据透射电镜(TEM)、NTA和WB的鉴定结果,我们获得了高质量的外泌体,用于后续电转和共孵育实验。


图二 外泌体鉴定(TEM、NTA、WB)


2)外泌体经电转和共孵育后,通过qPCR方法检测外泌体中miR-21-5p的水平,数据显示,电转后外泌体中miR-21-5p的水平显著高于共孵育后miR-21-5p的水平。

图三 qPCR检测外泌体中miR-21-5p含量


3)从转染的荧光结果来看,相比空细胞组,外泌体电转mimic NC后转染入目的细胞中的荧光强度要明显高于外泌体与mimic NC共孵育后在目的细胞中的荧光强度,故mimics通过电转进入外泌体的效率要远高于通过共孵育进入外泌体的效率。

图四 外泌体电转和共孵育转染荧光对比


4)从检测目的细胞中miR-21-5p的RNA水平可以看出,与上述转染结果一致,通过电转法将miR-21-5p转载入外泌体中,再用此外泌体转染目的细胞,发现目的细胞中miR-21-5p RNA水平显著高于用共孵育法带来的RNA水平变化。


图五 qPCR检测外泌体电转和共孵育对目的细胞中miR-21-5p RNA水平的影响


2.实验讨论:

基于本次的实验数据,我们可以看出,用电转法将miRNA转载入外泌体中是切实可行的,且效率要远高于用共孵育法。但是需要注意的是,不同批次不同来源的外泌体,其电转效率有差异,同时不同细胞摄取外泌体的能力不同,因此使用不同批次不同来源的外泌体电转时,需要做外泌体和miRNA梯度预实验确定以外泌体和miRNA的最佳使用量。


和元生物可提供外泌体分离、透射电镜(TEM)、纳米粒径分析(NTA)、WB标志物检测(CD9、CD63、CD81、TSG101、Calnexin)、外泌体流式检测、外泌体示踪、外泌体对细胞功能学影响、外泌体动物注射、活体成像、病理等服务。

外泌体载药之siRNA装载篇

1.实验结果:


1) 通过qPCR法检测电转组和共孵育组外泌体中siRNA水平,数据结果显示,电转组的RNA水平显著高于共孵育组,表明siRNA通过电转进入外泌体的效率较高。

图六 qPCR检测电转组和共孵育组外泌体中siRNA水平

2) 从细胞中外泌体的荧光情况看,电转组里除了外泌体本身的绿色,还有Bcl-2 siRNA的红色标记,说明Bcl-2 siRNA通过电转被装载入外泌体中;而共孵育组中基本没有摄入Bcl-2 siRNA,故通过电转法能将siRNA有效地装进外泌体中。


图七 电转组和共孵育组与细胞共培养24h后观察外泌体荧光情况



3)通过共聚焦显微镜观察电转组外泌体中siRNA的载入情况,从共聚焦显微镜拍摄的结果看,电转组外泌体中有进入了大量的Bcl-2 siRNA。


图八 共聚焦显微镜检测外泌体中siRNA装载情况


2.实验讨论:

通过本次实验数据可以看出,对于siRNA的外泌体装载,电转法装载的效率较高。后续实验可以进一步检测细胞中siRNA引起的基因水平变化,以及对应的细胞功能学的变化。未来的实验结果,我们拭目以待!


欢迎对外泌体载药感兴趣的老师们一起来探讨外泌体的载药效率、载药方法和治疗效果等。



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