文献解读| UXT通过靶向STING1进行自噬降解来减弱CGAS-STING1信号

  • 来源:北京索莱宝科技有限公司
  • 时间: 2022/9/16
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    文献背景

     

    CGAS-STING1信号通路对于介导先天性免疫中I型干扰素和其他促炎细胞因子的产生至关重要。通过胞质DNA刺激,CGAS产生内源性第二信使cGAMP,进一步激活STING1。作为一种关键的衔接蛋白,STING1协调信号转导以触发IRF3磷酸化和后续IFNs(I型干扰素)产生,以及多个ISGs(IFN刺激基因)和炎症细胞因子的下游表达。DNA对I型IFN的诱导对防御病毒感染和抗癌免疫至关重要。然而,据报道,STING1的过度激活与自身炎症和自身免疫性疾病有关,包括Aicardi-Goutières综合征/AGS,婴儿期发病的STING1相关血管病变/SAVI,以及SLE(系统性红斑狼疮)。因此,CGAS-STING1信号通路的活性,尤其是STING1信号通路的活性,必须经过精确而严格的调控,才能维持免疫稳态,以避免自身免疫性疾病的发生。已有研究表明泛素-蛋白酶体系统和自噬途径在CGAS-STING1信号通路中起负调控的作用.大家知道,这些程序在CGAS-STING1信号激活后不久就会启动STING1降解。然而,STING1周转的详细机制仍然有限。

    在真核生物中,自噬是清除受损细胞器、蛋白质聚集物和入侵病原体的重要而保守的过程。这一过程需要形成双膜结合的自噬体,随后与溶酶体融合,导致被隔离的底物降解和回收。自噬参与多种生理和病理过程,包括癌症、感染、炎症、神经退行性变和免疫等。自噬系统的成分可以直接抑制刺激I型IFN产生的蛋白复合物的激活。早期研究表明,ATG9A(自噬相关的9A)负向控制ER相关STING1的转运,并抑制TBK1(TANK binding kinase 1)的活化和下游I型IFN的产生。此外,其他研究表明,激活的STING1直接驱动自噬过程,其中TBK1磷酸化SQSTM1,使STING1降解。此外,STING1是一种潜在的自噬受体,通过其LC3相互作用区域基序直接与MAP1LC3/LC3(微管相关蛋白1轻链3)相互作用,介导自噬和自身自噬降解,调节先天免疫反应。另一项研究表明,STING1激活自噬,而该过程独立于TBK1的激活和干扰素的产生。尽管先前的研究表明,STING1信号通路与自噬过程之间存在很强的相关性,但STING1信号转导与自噬相互调节关系的详细调控机制仍不清楚。STING1信号与自噬机制之间的串扰需要进一步研究。

    UXT是一种小的伴侣蛋白,广泛表达于大多数组织中,并在脊椎动物物种中保守。先前的研究表明,UXT在小鼠视网膜退行性疾病和斑马鱼血管生成中发挥关键作用。此外,还发现UXT是NFKB/NF-κB转录增强体中重要的辅助因子。UXT普遍存在的表达模式和不同的生物学途径表明UXT的功能似乎是多效性的。UXT在其他生物学途径中的作用仍有待探索。在这项研究中,作者发现UXT是STING1介导的I型IFN信号通路中一个重要的负调节因子,通过SQSTM1选择性自噬降解STING1。该研究发现UXT通过选择性自噬与STING1特异性地相互作用并降解,从而避免了STING1的过度激活。在机制上,UXT通过激活CGAS-STING1信号通路,促进SQSTM1和STING1的相互作用,动态增强了STING1自噬降解。通过整合几个大型SLE白细胞和PBMC(外周血单核细胞)队列的基因表达谱,该研究进一步表明UXT的表达显著降低,并且与SLE患者的白细胞和PBMC中的I型IFN特征呈负相关。值得注意的是,UXT过表达导致SLE患者PBMC中I型IFNs和ISGs显著减少,这表明UXT可能是治疗自身免疫性疾病的一个新的治疗靶点。该研究揭示了UXT在调节CGAS-STING1信号通路活性中的重要功能,并为STING1信号通路与自噬过程之间的串扰提供了新的见解

     

     

    基本信息

     

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    题目:

    UXT attenuates the CGAS-STING1 signaling by targeting STING1 for autophagic degradation

    期刊:Autophagy

    影响因子:17.01

    PMID:35543189

    通讯作者:戴春笋

    作者单位:南京医科大学

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    摘要

     

    STING1是cGAS(环状GMP-AMP合酶)-STING1信号传导的关键衔接蛋白,对I型IFN产生先天免疫至关重要。然而,STING1的过度或长时间激活与自身炎症和自身免疫疾病有关。因此,防止STING1过度激活对于维持免疫稳态很重要。在该研究中,作者报道了UXT,一种小的伴侣蛋白样蛋白,对于通过SQSTM1(sequestosome 1)自噬降解STING1来防止STING1介导的I型IFN信号传导的过度激活至关重要。在DNA模拟物或环状GMP-AMP(cGAMP)刺激下,UXT与STING1特异性相互作用,并通过选择性巨自噬/自噬促进STING1降解。而且,通过促进SQSTM1和STING1的相互作用,需要UXT来更有效地自噬降解STING1。UXT在减弱CGAS-STING1信号传导中的体内作用在DNA病毒感染的小鼠模型和TMPD(2,6,10,14-四甲基十五烷)诱导的鼠狼疮模型中得到进一步证实。有趣的是,UXT的表达一直受损,并且与几个大型SLE(系统性红斑狼疮)队列的白细胞和PBMC(外周血单核细胞)中的I型IFN特征呈显著负相关。重要的是,UXT的补充有效地抑制了SLE患者PBMC中IFN和ISG的产生。总之,该研究揭示了UXT在STING1自噬降解以维持免疫稳态中的新调节作用。UXT可能是减轻自身免疫性疾病中异常I型干扰素的潜在治疗靶点。

     

     

    研究内容及结果

     

     

    1.UXT是CGAS-STING1信号通路的一种新型调控因子

     

    为了探索UXT在CGAS-STING1信号通路中的潜在作用,作者将靶向UXT的siRNA转染到MEFs(小鼠胚胎纤维细胞)中,siRNA转染实现了UXT敲除(图1A)。然后进行RNA-seq(RNA测序)实验,测量Uxt敲除和控制MEFs在刺激cGAMP后基因表达水平的分子变化。发现,与对照MEFs相比,敲除UXT导致大多数差异表达的ISGs明显更多(负二项检验,FDR<0.05)(图1B),这表明UXT可能在调控CGAS-STING1信号通路中发挥作用。与此相一致的是,显著上调的基因在先天免疫反应、免疫系统过程、细胞对干扰素-β的反应等生物学过程中强烈富集(图1C),这些都与CGAS-STING1信号激活相关。作者进一步通过real-time PCR验证了IRF3响应基因,Ifna4和干扰素刺激基因(Cxcl10,Isg15,Ifit1,Rsad2)的表达变化与RNA-seq数据一致,在cGAMP处理的UXT敲除的MEFs(小鼠胚胎纤维细胞)中,Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表达显著增加(图1D,E)。此外,在UXT敲除的MEFs中,由鲱鱼睾丸DNA(HTDNA)或干扰素刺激DNA触发的IRF3应答基因和ISGs的表达也显著增加(图1F,G)。IRF3磷酸化是CGAS-STING1信号通路激活的标志。与对照MEFs相比,在UXT敲除的MEFs中,由HTDNA和cGAMP触发的IRF3磷酸化增强(图1H,I)。总之,这些数据表明UXT是CGAS-STING1信号通路的一种新型调控因子。

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    2.UXT抑制CGAS-STING1信号响应

     

    作者研究了过表达UXT是否对CGAS-STING1信号通路有实质性影响。通过转染UXT表达质粒,进行RNA-seq实验,检测UXT过表达和对照MEFs在cGAMP刺激后基因表达水平的分子变化。转染成功实现了UXT的高效过表达(图2A)。与UXT敲除的MEFs的结果相反,过表达UXT显著下调了cGAMP诱导的大部分差异表达的ISGs表达(图2B)。此外,显著下调的基因在先天免疫反应、免疫系统过程、细胞对干扰素-β的反应等生物学过程中高度富集(图2C),其中大部分与UXT敲除实验重叠。为了进一步证实这一点,作者通过real-time PCR验证了IRF3应答基因及下游ISG基因的表达变化。在经过cGAMP处理的UXT过表达MEFs中,Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表达显著降低(图2D,E)。此外,过表达UXT还可以抑制HTDNA或ISD触发的IRF3-应答基因和ISGs的表达(图2F,G),并减弱HTDNA和cGAMP诱导的IRF3磷酸化(图2H,I)。综上所述,这些数据表明UXT是CGAS-STING1信号通路的抑制剂。

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    3.UXT缺乏增强了CGAS-STING1体内信号响应

     

    UXT基因缺失导致胚胎早期死亡。为了进一步证实UXT在CGAS-STING1信号通路中的作用,作者将loxP-flanked UXT纯合子小鼠(UXTfl/fl)与表达Lyz2/LysM-cre的小鼠杂交,获得骨髓细胞特异性UXT缺陷小鼠(UXTfl/flCre,UXT条件敲除[cKO])。为了检测UXT缺失的有效性,作者通过western blot方法分析了对照组和UXT cKO BMDMs(骨髓源性巨噬细胞)上的UXT表达。在UXT cKO BMDMs中基本上没有观察到UXT信号(图3A),表明UXT在髓系细胞中被有效地敲除。然后从对照组和UXT cKO小鼠制备BMDMs,用cGAMP刺激。采用RNA-seq实验检测cGAMP处理对照组和UXT cKO小鼠BMDMs基因表达水平的分子变化。结果表明,大多数在用cGAMP刺激后,UXT cKO BMDMs中差异表达的ISGs相对于对照组表达上调(图3B)。UXT cKO BMDMs中显著上调的基因在CGAS-STING1信号通路相关的生物学过程中强烈富集,包括先天免疫反应、免疫系统过程和细胞对干扰素-β的反应(图3C)。根据RNA-seq数据,实时PCR结果显示,与对照BMDMs相比,cGAMP处理的UXT cKO BMDMs中Ifnb、Ifna4、Cxcl10、Isg15、Ifit1、Rsad2的表达显著增加(图3D,E)。当使用HTDNA和ISD作为刺激时,也得到了类似的结果。此外,UXT的缺失促进了HTDNA和cGAMP诱导的IRF3磷酸化(图3F)。综上所述,这些数据证实了UXT在CGAS-STING1信号通路负调控中发挥作用。

    在DNA-病毒感染小鼠模型的基础上,作者进一步研究了UXT的体内功能。作者给UXT cKO小鼠和对照组同窝小鼠静脉注射HSV-1,并监测它们的存活率。UXT cKO小鼠感染HSV-1后的死亡率低于对照组(图3G)。此外,在感染单纯疱疹病毒1型(HSV-1)后,UXT cKO小鼠血清中IFNB蛋白的丰度明显高于对照组小鼠(图3H)。此外,UXT cKO小鼠在HSV-1感染后,清除病毒的能力增强,减少肺部炎症细胞浸润和组织损伤(图3I)。UXT cKO小鼠肺和脾脏组织中Ifnb和Ifna4 mRNA的表达明显高于对照组(图3J)。这些结果表明UXT在体内负调控CGAS-STING1信号通路中的作用。

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    4.UXT在STING1水平上调控CGAS-STING1信号

     

    为了确定UXT调控CGAS-STING1信号通路活性的分子机制,作者在HEK293细胞中过量表达UXT和CGAS、STING1、TBK1或IRF3 5D以及IFNB-荧光素酶报告基因。前期研究发现,CGAS-STING1-TBK1-IFR3轴的每个基因过表达均强烈激活CGAS-STING1信号通路,导致IFNB的诱导。因此,通过操纵UXT表达,同时过表达CGAS、STING1、TBK1或IRF3 5D,可以确定更特异的UXT调控的信号传导事件。结果显示,UXT可以减弱CGAS和STING1诱导的I型IFN信号,但不能减弱TBK1或IRF3 5D(图4A)。作者只观察到在UXT敲除细胞中CGAS和STING1介导的I型IFN信号通路显著增加(图4B)。在此外,UXT显著影响cGAMP诱导的IRF3应答基因的激活(图1D,E,图2D,E,图3D,E)。由于CGAS和TBK1分别在CGAS-STING1信号转导轴中作用于STING1的上游和下游,这些数据表明,UXT在STING1水平调控CGAS-STING1信号介导的I型IFN信号。紧接着,作者验证了UXT对STING1的调控作用。共免疫沉淀和免疫印迹分析显示,UXT与STING1特异相关,而UXT不与CGAS、TBK1或IRF3相互作用(图4C)。作者发现UXT和STING1之间的关联是动态调节的。HTDNA处理后,UXT与STING1发生相互作用,而HTDNA处理前,UXT与STING1的相互作用可以忽略不计,说明在激活CGAS-STING1信号通路后,UXT与STING1特异结合(图4D)。在cGAMP刺激后的UXT和STING1免疫沉淀实验中也观察到了类似的结果(图4E)。此外,作者进行了邻近连接实验,以证实HTDNA刺激后UXT与STING1相互作用(图4F)。综上所述,这些数据证实了UXT在CGAS-STING1信号激活后与STING1相互作用。

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    5. UXT促进STING1的自噬降解

     

    先前的研究报道,在CGAS-STING1信号激活后不久,STING1开始降解。作者注意到,HTDNA处理显著降低了STING1的蛋白水平。发现UXT过表达导致HTDNA刺激后STING1的加速降解(图5A)。当使用ISD和cGAMP作为刺激时,也观察到了类似的结果(图5B,C)。为了进一步验证这些结果,作者在HTDNA刺激后测定了UXT敲除细胞中STING1的蛋白水平,发现UXT敲除抑制了STING1的降解(图5D)。此外,UXT敲除也阻碍了在ISD和cGAMP刺激后的STING1降解(图5E,F)。综上所述,这些数据表明UXT促进了STING1的降解。

    在真核细胞中,蛋白质降解主要依赖于两条途径:泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径。作者进一步研究了两条通路中哪一条可能参与了UXT介导刺激后STING1降解。研究发现,自噬抑制剂3-MA(3-甲基腺嘌呤)和自噬-溶酶体抑制剂氯喹的处理可以恢复UXT过表达的STING1蛋白丰度下调,而蛋白酶体抑制剂MG132则不能(图5G,H),这表明UXT促进了STING1的自噬降解。为了证实这一点,作者进一步研究了UXT对自噬潮的影响,通过测定LC3的脂化,LC3是一种特征良好的自噬指标,自噬活性增加后升高。结果显示,在UXT敲除细胞中LC3-II显著降低,在UXT过表达细胞中LC3-II显著升高,说明UXT提高了自噬活性(图5I)。此外,UXT介导的IFN信号抑制在自噬抑制细胞中也被完全消除(图5J)。综上所述,这些结果表明UXT促进了STING1的自噬降解,从而进一步抑制STING1介导的I型IFN信号通路。

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    6.UXT促进了SQSTM1和STING1的互作

     

    作者继续探索UXT如何调控STING1自噬降解。已知有四种自噬受体可选择性靶向自噬降解蛋白:SQSTM1、NBR1、CALCOCO2/NDP52和OPTN(opti-neurin)。为了确定UXT介导的STING1自噬降解是由哪一种受体参与的,作者通过免疫沉淀和免疫印迹检测UXT与这4种自噬受体的相互作用。研究发现,UXT与SQSTM1特异相关,而未观察到UXT与其他三种自噬受体之间的相互作用(图6A-D)。为了检验这些发现的生理相关性,作者用HTDNA刺激细胞,发现在DNA模拟刺激后,UXT与SQSTM1强相关(图6E)。此外,在cGAMP刺激后,UXT也与SQSTM1相关(图6F)。总之,这些数据表明UXT在CGAS-STING1信号激活过程中与SQSTM1相互作用。此前有研究报道SQSTM1与STING1相互作用并介导STING1自噬降解。作者发现,在cGAMP刺激下,通过免疫沉淀和免疫印迹分析,SQSTM1与STING1相互作用。并发现UXT在HTDNA刺激后与SQSTM1和STING1同时相互作用(图6G)。此外,作者还发现,与对照组相比,UXT敲除细胞在HTDNA刺激后,SQSTM1和STING1的相互作用显著降低图6H)。当使用cGAMP作为刺激时也得到了类似的结果(图6I)。相反,在HTDNA或cGAMP刺激后,与对照细胞相比,在UXT过表达细胞中SQSTM1和STING1的相互作用显著增强(图6J,S4C)。为了进一步确定UXT与SQSTM1和STING1相互作用的结构域,作者利用一系列UXT的缺失突变体,发现UXT与SQSTM1-STING1相互作用需要UXT的N末端区域。综上所述,这些数据表明,UXT促进了SQSTM1和STING1的相互作用,从而促进了STING1的自噬降解。

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    7.UXT可缓解SLE患者的I型干扰素异常

     

    SLE是一种常见的自身免疫性疾病,其特点是I型IFNs和ISGs的异常诱导。考虑到UXT在调节STING1介导的I型IFN信号通路中的重要作用,作者研究了UXT在SLE患者中是否失调。作者对1211名SLE患者和139名健康者的4个大规模白细胞和PBMCs细胞基因表达谱进行了整合分析。发现在所有四个独立的SLE组中,UXT的表达均显著受损(图7A, Wilcoxon 秩和检验,p<10e−5)。UXT在SLE患者的T细胞、B细胞和单核细胞中均有下调,且没有明显的细胞型特异性(图7B)。UXT的表达表现出与I型IFN信号强负相关,I型IFN信号是通过21个成熟的ISGs(也称为21个IFNG信号)测量的。在所有四个SLE组中,几乎所有的比较中,UXT与这21个ISG基因的表达均呈显著的负相关(图7C,皮尔逊相关,FDR<0.05),并且UXT与21个ISG基因的整体表达相关性显著低于作为背景的四个SLE组(图7D,Wilcoxon 秩和检验,p<10e−10)。基于这些观察结果,作者研究了UXT表达是否可以调控SLE患者的I型IFN信号。从SLE患者的血液样本中分离PBMCs,并通过电穿孔转染空载体(Vec)或UXT表达质粒(UXT)。转染UXT表达质粒或其对照质粒48 h后,UXT处理的SLE患者外周血单核细胞中UXT mRNA水平明显高于Vec处理的SLE患者外周血单核细胞中UXT mRNA水平(图7E)。在UXT处理的SLE患者PBMCs,IFNB和ISGs(CXCL10,ISG15,ISG54,ISG56)mRNA水平显著降低(图7F-J),表明UXT减弱了SLE患者PBMCs中的I型IFN信号应答。综上所述,这些数据表明UXT可能是缓解SLE患者外周血单核细胞中异常I型IFNs的抑制因子。

    作者进一步研究了UXT在TMPD诱导的小鼠狼疮模型中的作用,与对照组小鼠相比,UXT cKO小鼠TMPD诱导的ISGs如Ifit1、Ifit3、Rsad2、Isg15和Gbp6表达明显增加,这与UXT对ISGs表达的负调控作用一致。狼疮肾炎是SLE的病理特征之一,其特点是肾小球免疫复合物沉积和尿素氮和肌酐蓄积。作者观察到,在TMPD治疗后,UXT cKO小鼠的肌酐和尿素氮水平明显高于对照组小鼠。此外,与对照组小鼠相比,UXT cKO小鼠肾小球IgG沉积也有所升高。总之,这些数据表明,UXT缺乏导致了ISGs的表达增加,并在TMPD诱导的小鼠狼疮模型中加剧了实验性狼疮肾炎。

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    结论

     

    作者发现UXT是STING1介导的I型IFN信号通路的重要负调控因子。在机制上,UXT特异性地与STING1相互作用,并在DNA模拟或cGAMP刺激后通过选择性自噬增强STING1降解。UXT通过促进SQSTM1和STING1的相互作用促进了STING1的自噬降解。病理上,UXT在SLE患者白细胞和PBMCs中表达受损,UXT的补充抑制了SLE患者PBMCs中I型IFNs和ISGs的产生。另一方面,作者通过对四组SLE患者的多个大规模基因表达谱的整合分析,发现STING1的负调控因子UXT在SLE患者的白细胞和PBMCs中显著下调。此外,UXT和I型IFN在SLE中显著负相关。因此,需要注意的是,UXT的过表达显著降低了SLE患者PBMCs中I型IFNs和ISGs的产生。虽然SLE是一种异质性疾病,但作者发现在四组独立的SLE患者中,UXT均持续受损。UXT有望成为治疗SLE患者I型干扰素活性异常的潜在靶点。

     

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