文献解读|细菌激发的可转化纳米颗粒靶向和覆盖残余肿瘤预防膀胱癌复发

  • 来源:北京索莱宝科技有限公司
  • 时间: 2022/9/30
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    文献背景

     

    膀胱癌(BCa)是男性第四常见恶性肿瘤,也是女性常见的恶性肿瘤,复发风险高。在BCa患者中,约75%为非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)。这些患者的标准治疗方法是经尿道膀胱肿瘤电切术(TURBT)后进行膀胱内化疗或免疫治疗。然而30-80%的NMIBC患者在初次手术治疗后5年内出现复发,产生巨大的医疗费用。研究表明,不良复发的原因是TURBT不完全,膀胱灌注效率低导致残留肿瘤持续或再生。临床上的膀胱内滴注化疗药物,由于在尿液滞留和排泄过程中的周期性稀释和冲洗,无法在残留的肿瘤区域精确地维持持续有效的药物浓度。尽管已经开发了合并纳米载体和药物递送系统以优化给药,但有限的疗效和未满足的安全性(如尿路梗阻和膀胱刺激的风险)限制了其临床应用。因此,为准确和彻底地杀死残留的肿瘤,迫切需要智能和安全的膀胱内制剂,即使在复杂的静脉内环境中也能实现精确的药物富集和长期释放

    临床上,TURBT优于膀胱内灌注。TURBT手术床不同于正常的尿路上皮,是残留肿瘤周围的特殊环境。它提供一个现成的特异性靶向平台,药物可以定位并直接进入杀死潜在的残留肿瘤细胞。虽然靶向手术床能够对残余肿瘤起到充分的杀伤作用,但膀胱这种pH值和渗透压不断变化的复杂液体环境,长期稳定的靶向作用是其临床应用的主要挑战。由于失去了皮肤等表层屏障的保护,细菌感染更容易发生在手术或烧伤等伤口上。细菌感染对伤口的偏好可能为解决手术床定位问题提供新的思路。细菌感染由与宿主细胞的黏附引起,宿主细胞上的细胞外基质(ECM)包括纤连蛋白(FN)、胶原蛋白、层粘连蛋白等通过细菌表面上的一组特定ECM附着分子为细菌直接黏附提供天然和多分子成分。在外部屏障被破坏后,损伤可能会暴露更多的ECM成分,从而增加稳定细菌黏附的机会(方案1a)。卡介苗(BCG)是一种活的、减毒的牛分枝杆菌菌株,它可以通过手术特异性粘附于破坏的尿路上皮而不在正常的尿路上皮表面附着,这启发作者实现膀胱手术床的特异性靶向。有文献表明BCG特异性附着是由两种成分介导的:BCG表面FN附着蛋白的FN结合肽(FBP)和TURBT手术暴露在手术床上的FN。

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    方案1

    多肽除了具有生物相容性外还具有结构和生物活性,是一种理想的生物材料。对多肽自组装特性的研究不仅揭示了从纳米粒子、纳米纤维到纳米网络的一系列形态,而且拓宽了其在生物体中的应用。作者代表性研究表明一系列自组装肽可以在实体瘤中原位特异而牢固地形成3D纤维网络,具有高蓄积性和长期滞留,用于归巢治疗药物、抑制转移等。根据这一发现,自组装肽基材料有望构建理想的药物递送系统,即使在流动和冲洗的膀胱内环境中,该系统也能在残留肿瘤部位精确分布并延长滞留时间。

    受细菌衍生的FN结合肽和暴露的FN之间的分子识别,特异性细菌粘附到伤口的启发,作者将这种肽引入自组装肽系统,并开发了细菌启发的可转化纳米粒子(BTN)。BTN肽由三个基序组成:(1)FN结合肽(GNRQRWFVVWLG)作为靶向基序,(2)氢键肽(KLVFF)作为自组装基序,(3)十二烷基链作为疏水基序(方案1b)。最初,BTN肽可以自组装成纳米BTN,并包裹阿霉素(DOX)以获得具有十二烷基和KLVFF基序疏水核心的DOX@BTN。DOX@BTN的工作原理如方案1c所示。(1)细菌引起的粘连:首先将DOX@BTN膀胱内给药,并在术后手术部位暴露FN。DOX@BTN在FN结合肽的引导下精确靶向暴露的FN,从而附着在残留肿瘤上。(2)转化和药物浓缩:疏水核心限制KLVFF堆叠在一起并形成组织良好的分子间氢键。一旦与靶标FN结合,BTN的配体与FN之间的结合力就打破了BTN疏水亲水平衡的限制,启动了氢键肽之间的分子间氢键作用。因此,BTN从纳米颗粒转变为具有β-折叠二级结构的纳米纤维(NFs),进一步形成覆盖残留肿瘤的纤维涂层。NFs中的疏水域很容易通过疏水和π-π相互作用捕获和储存DOX,从而丰富手术部位中的化疗药物。DOX@BTN确保DOX的精确富集和延长释放,不受周期性排尿的影响,直接有效地杀死残留的膀胱癌细胞并减少膀胱癌的复发(方案1c)。

     

     

    基本信息

     

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    题目:

    Bacteria-inspired transformable nanoparticle targets and covers residual tumor against bladder cancer recurrence

    期刊:Nano Today

    影响因子:18.962

    DOI:10.1016/j.nantod.2022.101551

    通讯作者:

    徐万海,王浩,王磊

    作者单位:

    哈尔滨医科大学附属第四医院泌尿外科

    国家纳米科学中心

    中国科学院纳米生物效应与安全性重点实验室

    索莱宝合作产品:

    产品货号

    产品名称

    K000214M

    Anti-FN1

    Monoclonal Antibody

    SEKF105

    ELISA套装

    SE068

    Streptavidin/HRP

    F8180

    Fibronectin From

    Human Plasma

    C8061

    Collagen Type Ⅰ

     

     

    摘要

     

    不完全手术留下的残余肿瘤再生导致膀胱癌复发。术后膀胱内灌注治疗因药物排空快、非特异性分布等原因,临床对复发的抑制效果不理想。作者受细菌通过纤维连接蛋白结合肽与裸露伤口内在黏附的启发,开发了一种细菌激发的多肽纳米颗粒,靶向手术中肿瘤残留暴露的纤维连接蛋白。纳米颗粒结合后转化为纤维涂层,作为药物储库长期释放包裹的阿霉素。在灌注3天后,可转化纳米颗粒在小鼠膀胱内保留的阿霉素浓度比游离的高8.5倍。在不完全肿瘤切除模型中,这种配方明显抑制了肿瘤的再生长。与临床阿霉素治疗相比,在小鼠原位膀胱癌模型中,它将复发率从71%降低到29%。这种生物材料不仅提供了一种膀胱内治疗方法,也为癌症复发的临床治疗提供了机会。

     

     

    研究内容及结果

     

     

    1.溶液中BTN与FN结合转化行为的表征

     

    根据固相多肽合成方法(图S1),作者合成了FN可靶向和可转化的C12-KLVFF-GNRQRW-FVVWLG型BTN多肽,以及两个对照肽C1-BTN多肽(C12-KLVFF-GVRLWVQFRNWG)和C2-BTN多肽(C12-KAAGG-GNRQRWFVVWLG)。C1-BTN肽含有FN结合肽的自组装基序,但不是靶向的扰乱序列。C2-BTN多肽具有FN靶向基序,但缺乏自组装序列。因此,C1-BTN和C2-BTN都被设计成不能转化为纤维结构。采用快速沉淀法制备纳米BTN和对照BTN(40μM,H2O:DMSO = 99:1,v/v)。作者尝试探索包括FN结合肽的BTN是否保留了特定的FN靶向能力。从黏附阵列(图1A)可以发现BTN和C2-BTN对预包覆的FN层的结合能力分别是C1-BTN(扰乱靶向序列)的2.7和2.4倍,表明FN结合肽赋予纳米FN靶向能力。BTN与FN的结合能力分别是牛血清白蛋白(BSA)、胶原和层粘连蛋白的4.3、3.0和3.6倍,表明BTN具有与FN的特异性结合能力。另外通过分子动力学模拟预测了BTN在FN内的结合域。FN的第13型结构域(即FNIII13)在所选的FN结构域(FN的7-10、11、12、13和14-16型结构域)中范德华和库仑相互作用能最大,表明BTN与FNIII13结合较强(图S2)。然后,根据FN结合肽RWFV序列中结合能低、活性位点最多的位点,通过分子对接,筛选出较好的蛋白肽结合模型(即FNIII13-BTN肽)。目标基序的VWLG序列与FN的T11,K19,I20,Y22,E23,E53,D55,A57之间发生了大的疏水相互作用(图1b)。BTN肽和FN通过分子对接的代表性结合结构,这种结合引发了BTN到纳米纤维的转化(图1c)。

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    图S1

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    图S2

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    图1

    通过透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)研究FN诱导的BTN转变。添加FN在37℃下1小时,可观察到平均直径为10.8 nm的NFs,而在相同条件下,未添加FN的BTN仍保持纳米级结构(图1d;图S3)。无论是否在37℃下添加FN 1小时,C1-BTN和C2-BTN都只表现出纳米形貌(图S3)。单独的FN在透射电镜下既没有完整的ECM呈现明显的纳米连接也没有纤维状网络,而是呈现单体形态(图S4)。BTN在37℃下与FN孵育1h后,其平均流体力学直径从68.1 nm变为多分散的220.0和955.0 nm,表明BTN向非**氮化物转变,但在没有FN孵育的BTN溶液中只检测到直径的微小变化(图1E)。DLS数据显示C1-BTN和C2-BTN在直径w/wo FN范围内变化不大(图S5)。通过圆二色谱(CD)分析BTN多肽在转化过程中的二级结构。BTN与FN孵育1 h后CD信号特征明显,在195 nm处CD信号为正,在216 nm处CD信号为负,表明BTN在FN诱导下通过氢键相互作用自组装成富含β折叠结构的NFs(图1f)。但由于缺乏可变性C1-BTN和C2-BTN w/wo FN都没有表现出典型的β折叠结构特征信号。随着BTN肽浓度的增加,BTN的CD光谱显示出更多特征性的β折叠结构CD信号(在195 nm处为正CD信号,在216 nm处为负CD信号)。根据CD光谱估计二级结构,随着BTN浓度从10增加到40μM,β-折叠二级结构的比例升高,高于CMC(5.46 μM)(图S6)。通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)进一步研究了所得NFs的详细堆积结构。FN孵育1小时后,BTN在酰胺I区1633cm-1处显示出代表C═O拉伸振动的特征带,表明NFs中存在平行β折叠结构(图1g)。富含β-折叠聚集体的荧光探针硫黄素T(ThT,10 μM)用于评估自组装进展。于形成了β折叠结构的神经纤维,BTN+FN组的荧光强度比BTN组增加了4倍。在激光共聚焦扫描显微镜下,FN处理的BTN溶液中可见明显的增强荧光的缠绕纤维聚集,表明形成了具有β折叠结构的NFs(图1H),而FN单独处理组和FN处理的C1/C2-BTN组显示出黑色的背景,没有明显的荧光集合体(图S7)。通过分子动力学模拟研究BTN的形态转变。在80 ns内,BTN在FN诱导下呈现由粒子向纤维转化的趋势,而C1-BTN和C2-BTN的构象没有明显变化(图S8)。上述结果表明,BTN向NFs的转化过程由GNRQRWFVVWLG与FN结合启动,随后KLVFF通过分子间氢键自组装驱动。

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    图S3

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    图S4

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    图S5

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    图S6

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    图S7

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    图S8

     

    2.体外BTN精确结合、自组装和长时间滞留

     

    在确认转化特性是由FN结合和两个序列的自组装双重支配后(图2a),用多细胞球状体(MCSs)验证FN的特异性粘附和向NFs的转化。首先,用ELISA法检测加入转化生长因子-β的正常成纤维细胞L929和人胚胎肾细胞HEK293中FN的差异表达。经转化生长因子-β处理的L929细胞培养上清液中分泌的FN是HEK293细胞的25.2倍(图2B)。将TGF-β处理的L929细胞作为FN+组,HEK293细胞作为FN-组。Cy5标记的BTN、C1/C2-BTN(40 μM,培养基:DMSO=99:1,v/v)分别与FN+或FN- MCS孵育1小时,用PBS洗去后用CLSM观察。用Cy5标记的BTN和C1/C2-BTN培养的FN-HEK293 MCS在冲洗后的荧光可忽略不计。相比之下,与Cy5标记的BTN和C2-BTN孵育的FN+(L929 + TGF-β)MCSs显示阳性荧光信号(图2c),分别比Cy5标记的C1-BTN孵育的MCSs高4.4倍和3.8倍(图2d)。结果与结合试验结果一致(图1a),进一步证实了BTN的特异性FN结合能力。

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    图2

    作者进一步研究了BTN向NFs的转化以及相应的体外生物保留能力。将MCSs与Cy5标记的BTN和C2-BTN共同孵育6h,分别于第0、1、2、3、4、5天观察,每次观察前更换MCSs的培养液。如图2e和图2f所示,在Cy5标记的BTN和C2-BTN组中,在第一个时间点都检测到比较荧光。C2-BTN组第二天荧光信号急剧衰减,第三天出现微弱的荧光信号,相比之下BTN处理的MCSs显示出长期的荧光信号。第5天BTN组的剩余荧光强度仍达到初始荧光强度的60.1%,几乎是C2-BTN组的两倍(图2e,f)。这种长时间的荧光可能是因为BTN转化成的NFs型,它牢固地附着在MCSs上,耐洗涤并长期保留。为了验证BTN的牢固附着,使用扫描电子显微镜(SEM)直接观察经BTN处理1h后的MCSs表面。在MCSs上观察到缠绕的纤维网络,可能是来自BTN的交织的NFs,验证了牢固的附着。相比之下C2-BTN处理的MCS的表面呈现出相对光滑的外观,表明C2-BTN在培养基更换期间被洗去(图2g)。经Cy5标记BTN处理的L929 MCSs用ThT进行染色,CLSM图像不仅显示ThT在480 nm处的绿色发射荧光增强,而且与Cy5的红色荧光共域,Pearson相关系数(PCC)为0.77,提示MCSs中具有β折叠结构的NFs(图2h)。C2-BTN组的ThT荧光显示较低的PCC(0.56),Cy5标记的C2-BTN荧光呈红色,表明C2-BTN的β折叠结构较少。综上所述,这些结果表明BTN可在细胞微环境中与FN牢固结合,并在MCSs上自组装成具有β折叠结构的相互交织的NFs,从而延长滞留时间,可作为化疗药物的富集和缓释库。

     

    3.小鼠膀胱内BTN的靶向、转化和滞留

     

    为验证TURBT手术前后靶向FN的定位,对C57BL/6小鼠和人的膀胱组织进行分析。小鼠模型采用盐酸剥蚀损伤尿路上皮完整性的方法模拟手术对小鼠尿路上皮的损伤。小鼠膀胱组织免疫组化研究显示FN位于完整的尿路上皮下,盐酸剥蚀后出现在管腔表面。在正常和损伤的膀胱组织上用电灼法观察到同样的现象。这些结果表明术后FN将暴露在手术床上,验证了靶标的可靠性(图3a,b)。以此为靶点进行一系列实验,以评价BTN在体内的结合、转化和滞留情况。用酸剥离法损毁小鼠膀胱,然后分别注入染料标记的BTN、C1-BTN和C2-BTN,每组3只。灌胃后1h处死小鼠,取膀胱组织进行免疫荧光染色。Cy5标记的BTN和C2-BTN的红色荧光出现在膀胱内壁,并与FN荧光信号(绿色)有很好的共定位。与C1-BTN孵育的膀胱只有绿色荧光,几乎没有红色荧光。(图3C;图S9)。利用体内成像系统(IVIS)对体外膀胱的荧光成像,Cy7标记的BTN组的荧光信号与Cy7标记的C2-BTN组相当,但比非靶向C1-BTN组高4.4倍(图3D)。这些结果表明,纤维连接蛋白结合肽的FN靶向性有助于BTN和C2-BTN在体内的积累。

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    图3

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    图S9

    作者使用小鼠原位膀胱模型(n=3)进一步研究了BTN和C2-BTN在膀胱内的滞留,该模型提供了具有动态流体环境的人类膀胱的真实模拟。将Cy7标记的BTN和C2-BTN注入酸蚀的膀胱。膀胱区的荧光信号以时间依赖的方式被监测和量化(图3e,f)。BTN治疗组膀胱内荧光信号从4 h开始减弱,但速度相对较慢,在膀胱内排尿时表现出较好的抗排尿能力,而C2-BTN组在注射后12 h内迅速下降。BTN组在72 h仍可观察到清晰的BTN荧光信号,而C2-BTN组在42 h后未见明显的荧光信号。每组的保留效率以起始荧光信号的百分比为指标,72 h时BTN组为21.0±5.7%,是C2-BTN组(3.2±0.9%)的6.6倍(图3e,f)。在心、肺、脾等系统器官中,几乎没有荧光信号,表明BTN膀胱内灌注的生物安全性(图S10)。最后,使用Bio-TEM和扫描电子显微镜分别验证了受损膀胱中的纤维涂层和交织纤维涂层(图3g)。生物显微镜观察发现BTN组大鼠膀胱内壁表面有明显的纤维结构,而C2-BTN组大鼠膀胱内壁表面无明显纤维结构(图3h)。相应的能量色散光谱(EDS)分析也鉴定了碘标记的BTN多肽在纤维结构上产生的I特征信号(图S11)。通过扫描电镜观察到BTN组扩张性膀胱壁呈纤维状包膜(图3i),而在C2-BTN处理的膀胱内腔表面无纤维结构,可见少量颗粒状碎片。在活鼠膀胱中,BTN能精确靶向手术床自组装成NFs,牢固地附着在膀胱内表面。这些结果为活体小鼠手术床中BTN的高积累和长期滞留提供了直接证据,这对药物的富集和持续释放至关重要。

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    图S10

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    图S11

     

    4.在模拟手术床中,DOX@BTN的DOX富集和长期释放

     

    据报道小分子倾向于通过疏水和π-π相互作用插入肽纳米结构中。BTN通过捕获和储存疏水性化疗药物,可作为一个药库。首先,用芘荧光探针法测定BTN和对照C2-BTN多肽的临界胶束浓度(CMC)来评价包封性。BTN和C2-BTN的CMC值分别为5.46和11.13 μM,表明BTN比C2-BTN更倾向于胶束化,可能具有更强的包封效率(图S12a,b)。DOX通过共组装加载到BTN(DOX@BTN)和C2-BTN(DOX@C2-BTN)中。DOX@BTN和DOX@C2-BTN的紫外可见吸收光谱在485 nm处出现了DOX的特征峰(图S12c,d)。与C2-BTN相比BTN的包封率(37.3% vs 26.3%)和载药效率(27.2% vs 20.9%)分别提高了1.4倍和1.3倍,可能与BTN的疏水区域更大有关。分子动力学模拟显示在80 ns时,DOX在BTN中比C2-BTN中分布更集中。DOX@BTN与DOX@C2-BTN相比,DOX的溶剂可及表面积(SASA)更低,说明BTN具有较高的包封能力(图S12e)。以质量比(BTN/DOX,0.16,0.5,0.6,1.1,1.6)为标准,采用透析法制备不同批次的DOX包埋BTN。随着DOX含量的增加,载药效率提高达到30%左右,包封效率降低(图S12f)。为确定DOX负载纳米颗粒的转化性质用透射电镜和DLS表征在FN诱导下DOX@BTN、C1-BTN和C2-BTN的形态和尺寸分布。与未载药的纳米颗粒一致,只有经FN处理1 h的DOX@BTN出现了明显的由纳米颗粒向纳米纤维的形态转变和DLS变化,尽管有FN诱导,DOX@C1-BTN、DOX@C2-BTN仍保持纳米颗粒的形态,纳米颗粒大小变化不大(图4a;图S13)。在与FN孵育1 h后,DOX@C2-BTN的颗粒尺寸变小,这表明FN结合可能介导了纳米颗粒的解离。通过平衡透析绘制药物释放曲线,研究BTN向NFs转化过程中DOX的释放行为(图S14a)。将DOX@BTN、DOX@C1-BTN和DOX@C2-BTN与FN混合后分别加入透析膜中。将DOX@BTN与FN(20nM)孵育2 h后,直接制备DOX@NFs进行透析。在FN的诱导下,DOX@C2-BTN(无自组装基序)在120 h内快速释放了57.8%的DOX,而DOX@C1-BTN(FN结合肽的杂乱序列)在120 h内释放缓慢,释放量最少(16.9%)。对于有NFs形成的组,DOX@BTN与FN和DOX@NFs混合后的DOX存储量分别为71.9%和70.2%,显示出DOX的持续释放,长期药物暴露杀死癌细胞。曲线显示与DOX@NFs相比,DOX@BTN+FN在前4 h表现出相对较快的释放,这一快速释放阶段可能是由于结合FN启动了从纳米BTN到NFs的结构转变。C1-BTN的缓释行为可能是由于FN失去了启动转化的靶向性。DOX@BTN+FN组在4 h后表现出缓释特征,这意味着DOX仍然存储在NFs中(图S14a)。这些结果证实尽管通过FN结合增加了药物释放,转化的NFs通过捕获DOX在NFs中成为药物保留的主导。计算包含DOX@BTN和FN在80 ns内的均方根(RMSD)值。与DOX@C2-BTN-FN相比,DOX@BTN的RMSD变化较小,表明DOX@BTN具有缓释性质(图S14b)。

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    图S12

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    图4

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    图S13

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    图S14

    为了验证DOX@BTN具有靶向和长期抗癌作用的优越性,使用实时细胞分析(RTCA)来动态监测DOX@BTN对细胞活力的影响,同时进行常规CCK-8检测(图S15)。图4b演示了实验方法。为提供丰富的靶细胞(FN)以便更好地转化,在RTCA孔的底部预涂FN,然后接种膀胱癌细胞(MB49),完全模拟了一个含有癌细胞残留的体外伤口。DOX@BTN和游离DOX(临床传统治疗方式作为对照)在MB49附着生长后添加。1小时后用无DOX培养液更换上清液以模拟尿液冲洗,同时记录细胞存活率(图4b)。两组细胞存活率在 4h内先略有升高,之后逐渐下降。DOX@BTN组的下降速度明显快于游离DOX组。在72 h时,DOX@BTN对细胞活力的抑制作用明显强于游离DOX(图4c)。为证实在体外创伤模拟RTCA模型中是否形成了由纳米纤维组成的纤维涂层,使用扫描电子显微镜观察了预涂有FN的RTCA孔上的细胞(图4d)。如图4e所示,在DOX@BTN孵育1 h的细胞周围观察到成簇的纤维涂层,但游离DOX处理1 h后细胞仍保持黏附,没有纤维涂层,由于冲刷,细胞背景清晰。培养上清与DOX或DOX@BTN孵育1 h后更换,继续培养24 h。扫描电镜显示DOX@BTN组细胞被纤维包膜覆盖,细胞缩小碎裂,游离DOX组细胞与1 h时情况相似,背景清晰,无额外结构(图4e)。这些结果清楚地证明了在MB49细胞周围形成由NFs组成的纤维涂层的证据,表明DOX@BTN通过与FN结合靶向并覆盖MB49细胞,实现DOX的长期杀伤作用的持续释放。

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    图S15

    基于在体内发现交织纤维涂层的高蓄积和长时间滞留,作者测试了纤维交织涂层对DOX的耐尿性和缓释行为。酸蚀膀胱组灌胃阿霉素,同时灌胃游离阿霉素(0.5 mg/mL,相当于920 μM)。收集尿液中释放的DOX,在不同时间间隔内进行测量(图4f)。尿液中的DOX浓度反映了膀胱内的药物含量。经膀胱内给药可使DOX在膀胱内定位,直接到达癌灶,发挥最大的治疗效果。如图4g所示,游离DOX组在16 h内快速排泄,导致药物快速消耗。DOX@BTN组药物排泄缓慢,24 h后尤为明显。DOX@BTN处理膀胱排出的DOX浓度显著高于未处理膀胱排出的DOX浓度。DOX@BTN处理后膀胱72 h释放的DOX浓度为11.8 μM,仍高于游离DOX的IC50值(1.4 μM),是游离DOX对照组的8.4倍(图4g,图S15)。将DOX@BTN和游离DOX分别与电灼伤小鼠的体外膀胱孵育。与游离DOX组相比,DOX@BTN组开放膀胱在靶区即手术床上显示出较强的DOX荧光,证实了手术床内药物的精确浓缩。DOX@BTN组手术床上DOX的荧光强度(信号)与正常膀胱壁(噪声)的比值是游离DOX组的2.2倍(图S16)。结果证实DOX@BTN通过与暴露的FN结合,能够特异性地靶向手术床,并有效地保留了DOX在体内的长期抗肿瘤作用。

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    图S16

     

    5.DOX@BTN对不完全肿瘤切除模型的残留肿瘤抑制作用

     

    作者进一步评估了DOX@BTN对膀胱残余肿瘤再生的抑制作用。首先,将MB49-Luc细胞移植到皮下制备异种移植瘤。14天后,肿瘤被摘除并缝合,留下可见微小肿瘤病变(不到原始肿瘤体积的1%)的空洞作为残余肿瘤。手术后生物发光的显著减少验证了残余肿瘤的成功制备(图S17)。将四种制剂(PBS、DOX和BCG作为临床对照,DOX@BTN)注射到切除腔中,然后在每次治疗后用PBS冲洗,建立模型的步骤很好地模拟了临床膀胱内灌注的过程(图5a)。DOX@BTN组6只小鼠中有2只在治疗结束时未见明显肿瘤,其余3组小鼠均肿瘤复发。PBS治疗的肿瘤在不完全切除后随时间呈指数增长,在结束时间点平均肿瘤体积达到553.5 mm3。DOX组肿瘤生长明显延迟,截止时间平均肿瘤体积为257.1 mm3。BCG组肿瘤被中度抑制,平均肿瘤体积为384.7 mm3,可能是由于人工腔内缺乏免疫细胞转运所致。DOX@BTN显示出对残余肿瘤再生的有效抑制,平均肿瘤体积为100.7mm3(图5b,c)。通过免疫组织化学和H&E染色证实了肿瘤摘除后腔内残留肿瘤负荷的丰富FN表达,成功模拟了不完全TURBT后FN暴露的残留肿瘤。因此DOX@BTN能够结合并保留在手术床上进行精确的药物释放,对残留肿瘤的复发具有优异的抑制效果(图5d;图S18)。此外,DOX@BTN治疗的小鼠体重几乎没有受到影响,并且显着高于DOX组(图5e)。所有结果证实转化为NFs后的DOX@BTN可作为具有长期肿瘤杀伤作用的化疗药物库,降低复发风险。为评价DOX@BTN的安全性,在终点采集血样和主要器官。测定血清ALT、AST、ALP、TP、ALB、GLOB、CRE、BUN等生化指标。DOX@BTN组与PBS组无明显差异,说明DOX@BTN组无系统性毒性(图S19a-c)。多器官病理切片结果表明特异性富集和长期保留的DOX@BTN不会引起不良的病理改变(图S19d)。

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    图S17

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    图5

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    图S18

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    图S19

     

    6.DOX@BTN对小鼠原位膀胱癌复发的抑制作用

     

    作者进一步研究了DOX@BTN在小鼠原位膀胱肿瘤模型中的疗效(图6a)。将MB49-luc细胞植入小鼠膀胱,用IVIS实时监测小鼠的动态,通过生物发光成像记录肿瘤生长(图6b)。所有小鼠在肿瘤孵育后第3天的膀胱中都显示出类似的微弱生物发光信号,这表明发育良好的微小肿瘤病灶模拟了最小的残留肿瘤。为更好地刺激术后环境,用24-G留置针抓挠膀胱内壁,使伤口更多地暴露FN。之后根据膀胱术后的临床给药情况,分别于不同时间点(第3、5、7、10、17、24天)将PBS、DOX、BCG、DOX@BTN 4种膀胱内配方注入小鼠膀胱(n = 7)。PBS组小鼠肿瘤复发,7只小鼠中有2只在1个月内死亡。BCG治疗组小鼠肿瘤复发控制增强,复发率为57%,而游离DOX组为71%,这与TURBT后BCG在预防肿瘤复发方面优于TURBT后化疗的临床结果相一致。与不完全切除模型相比,原位模型中BCG疗效的提高可能与更真实的生理条件有关,具有更好的药代动力学特性和完整的生物活性,如血管正常,有利于抗原呈递和免疫细胞的募集。这也可能是由于不完全切除实体瘤,但切除了大部分实体瘤后,肿瘤负荷比治疗前的原位模型更大。与其他组相比,DOX@BTN治疗的小鼠明显表现出肿瘤生长抑制。DOX@BTN治疗明显降低了肿瘤复发率,从71或57-29%(DOX或BCG vs DOX@BTN)(图6c,d)。DOX@BTN治疗对体重的影响与不完全切除模型的结果一致(图6e)。此外,DOX@BTN治疗能显著延长小鼠的生存时间。7只小鼠中有5只存活超过60天,而PBS组、DOX组和BCG组中存活天数分别为33、43和49天(图6f)。这些结果表明,DOX@BTN通过FN靶点抑制原位膀胱肿瘤的复发表现出优异的疗效。为进一步证实癌残留膀胱内纤维涂层的形成,扫描电镜观察原位小鼠膀胱DOX@BTN组。膀胱解剖后经大体检查发现膀胱组织有肿瘤病变,经HE染色得到证实。通过免疫组化染色验证FN表达和暴露(图6g;图S20),纤维结构分布在有肿瘤负担的膀胱表面,这为原位膀胱癌模型中BTN从纳米颗粒转化为纳米纤维提供了直接和有力的支持(图6h)。

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    图6

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    图S20

     

     

    结论

     

    受细菌对伤口黏附的启发,作者成功开发了一种细菌诱导的可转化纳米颗粒(BTN),用于预防膀胱癌复发。负载药物的BTN能够通过细菌衍生肽(FBP)与暴露的FN结合,精确地粘附在残留肿瘤的手术部位。在靶向FN的引导下,DOX@BTN转化为纤维涂层,具有长期滞留作用,有助于DOX在残留肿瘤中的持续释放,达到精确杀伤的目的。作者建立了不完全切除模型来模拟术后残留肿瘤。在该模型中,DOX@BTN可明显抑制肿瘤再生。在原位膀胱癌模型中,DOX@BTN组与传统膀胱内灌注(DOX)相比,复发率从71%降低到29%。大多数注射了DOX@BTN的小鼠至少存活了60天。这种BTN不仅为抑制膀胱癌的复发提供了一个全新的视角,而且也是彻底治愈膀胱癌的最佳临床替代方案。在临床实践中,这种智能配方为管理其他实体肿瘤的复发提供了机会。

     

    索莱宝产品亮点

     

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