夹心法ELISA操作步骤

分别设定标准孔、0孔和样本孔，计算好当次试验所需要的板条数量，将不需要的板条拆卸下来，用新的封板膜重新封好，放回装有干燥剂的铝箔袋。

浸泡酶标板：加入300 μL 1×洗涤液静置浸泡30秒，弃掉洗涤液之后，在吸水纸上将微孔板拍干，重复2次。

加标准品：标准品孔加入100 μL的2倍倍比稀释的标准品。0孔加入100 μL标准品/样本稀释液。

加样本：样本孔加入100 μL的待测样本。保证连续加样，不要间断。加样过程在10 min内完成。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃静置孵育90 min。

洗涤：弃掉液体，每孔加入300 μL洗液洗板，洗涤4次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

加生物素化检测抗体：加入100 μL生物素化抗体工作液至反应孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。37℃静置孵育60 min。

洗涤：弃掉液体，每孔加入300 μL洗液洗板，洗涤4次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

加酶结合物：加入100 μL酶结合物工作液至反应孔中。

孵育：使用新的封板膜封板。封板后于37℃静置孵育30 min。

洗涤：弃掉液体，每孔加入300 μL洗液洗板，洗涤5次。每次洗板，在吸水纸上拍干。

加底物显色：每孔加入100 μL显色底物TMB，避光，37℃避光显色15 min。

加终止液：每孔加入50 μL终止液，终止液加入的顺序应尽量与显色底物加入的顺序相同。

检测读数：在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值。