上海吉至实验室详解单克隆抗体的制备过程 购产品送口罩

  • 来源:上海吉至生化科技有限公司
  • 时间: 2020/6/30 15:51:00
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    单克隆技术又名杂交瘤技术。由G.KÖhler和Milstein1975年创立。主要原理是利用产生抗体的B细胞与肿瘤细胞杂交融合成杂交瘤细胞,生产抗体。

     

    单克隆抗体的制备过程主要有以下六个环节,具体为抗原指标、免疫动物选择、免疫程序的确定、免疫、细胞杂交与选择培养。

    下面详细介绍单克隆抗体制备过程每一步的做法。

    1、抗原制备 

      制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛选的工作量。因此,免疫抗原是越纯越好,应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。

    2、免疫动物的选择 

      根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠,所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物。种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失。就小鼠而言,初次免疫时以8-12周龄为宜,雌性鼠较便于操作。 

    3、免疫程序的确定

      在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。没有一个免疫程序能适用于各种抗原。免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射,也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射,目前尤其推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好, 

    注:体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原,对于免疫原性很弱或对机体有害(如引起免疫抑制)的抗原就不适用了。如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。因此,针对这些情况,可采用体外免疫。所谓体外免疫就是将脾细胞(或淋巴结细胞,或外周血淋巴细胞)取出体外,在一定条件下与抗原共同培养,然后再与骨髓瘤细胞进行融合。

    4、 免疫前的准备

    佐剂是非特异性免疫增强剂,与抗原一起注射或预先注射入机体内时,可增强机体对抗原的免疫应答。

    5、免疫 

    用佐剂和抗原按照1:1的比例进行混合,混合后进行磨合。磨合可以使用玻璃针管反复推拉,至佐剂抗原滴入水中既不会产生大面积油花,也不会分层。取一定量佐剂抗原对免疫动物进行分段多次注射。

    注意:在注射的时候要小心,不要感染免疫动物。

    6、细胞杂交与选择培养

    (1)杂交筛选:细胞杂交之前,要分别准备好脾脏的B细胞悬液和小鼠骨髓瘤细胞。免疫后的小鼠脾脏在无菌条件下破碎,将B细胞悬浮在没有血清的培养液中并洗涤3次去掉小鼠的血清。细胞用培养液洗涤2-3次,把两种细胞合并在同—试管中,用50%的聚乙二醇作为融合剂,在37℃条件下融合1-2min。用培养液缓慢稀释,除去PEG,将存活细胞分散至HAT选择培养板中。融合后的细胞在培养皿上用HAT培养液(培养液中含10%-20%胎牛或小牛血清和HAT)在37℃,5%CO2进行培养。形成可用的细胞克隆后经过几次更换培养液后进行抗体活性检测(见抗体检测)。分离单个细胞置入多孔培养板的每个孔中培养,检测每孔细胞是否产生所注射抗原的抗体。

    注意:在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常需要加入饲养细胞使之繁殖。常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞。

    (2)细胞培养:将筛选出来的细胞直接注射到小鼠的腹部,培养3-4天。吸取培养好小鼠的腹水,将抽取的腹水进行梯度离心就可以分离到纯净的单克隆抗体。

    注意:细胞也可以在体外进行培养,不过体外培养对环境要求极高,很容易就感染了菌株从而造成整个实验的失败。在抽取腹水的时候不要多次抽取,尽量一次抽取成功,否则很容易感染菌株。

      以上为单克隆抗体的制备过程详细解释。上海吉至生化提供整个实验全部生化试剂、耗材及设备销售,欢迎老师、同学选购。

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