抗体制备中抗原的选择与制备方法

  • 来源:福因德科技(武汉)有限公司
  • 时间: 2021/3/16
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    抗原对于抗体的制备至关重要,好的抗原是制备优质抗体的前提,不同用途需求的抗体需要不同类型的抗原,所以抗原设计或者是制备不当是不可能得到好的抗体,更别说是适合于特殊需求的抗体了。

    那么一个好的抗原需要具备哪些普遍性特点呢?

    抗原通用特点:

    分子量大:大分子物质能长时间留在机体内,有更多机会和免疫细胞(主要是巨噬细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞)接触,引起免疫细胞作出免疫反应(佐剂最主要的原理之一就是油状物质包裹在体内缓慢释放,使其长时间留在体内);而对于小分子物质,体内代谢很快将其排出体外,没有机会与免疫细胞接触;同理,即使大分子蛋白太容易降解的也不适合做抗原。小于4kD的蛋白很难激发抗体的原因,一反面是因为其容易被排出机体;另外一方面平均每5-10kD的蛋白才有一个抗原表位也就是抗原决定簇(epitope),按照平均值来说,分子量太小的蛋白很难有有效表位。

    外源性强:个体形成的早期,机体对自身物质形成免疫耐受,与机体物质相似度很高的物质一般不会引起机体产生免疫反应,只有异质性的物质侵入体内,机体才能迅速对抗外来物质的侵害,保护自身;但是机体对有些部分如大脑,眼球,睾丸等物质成分不会产生免疫耐受,此区域成为免疫赦免区,如果以此类物质作为抗原可以不考虑免疫耐受和外源性问题。

    结构复杂:外源性只是从归类宏观角度上论述抗原性问题,实际上从微观上来说,作为抗原的分子物质的结构必须尽可能复杂,简单重复的序列或者直链物质(比如:糖、氨基酸)组成的序列一般抗原性都很弱,这类物质比如明胶、淀粉、核酸和多聚氨基酸等;

    降解性好:作为抗原,必须是可以降解才能抗原提呈;塑料、钢铁等难降解的物质免疫原也很弱。因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽,所以由D-型氨基酸组成的物质免疫原性都很弱。

    常用的抗原的制备途径究竟有哪些: 

    • 天然提纯抗原:

    从机体纯化的天然提纯抗原(主要是蛋白质)保持了抗原本身结构(自身修饰,正确构象)特点,但是天然抗原的纯化难度比较大,蛋白纯化在世界范围内都是一个难题,并且只有表达比较量高的天然蛋白才能比较容易纯化。天然蛋白是一种很好的抗原,用天然蛋白做抗原制备的抗体,一般适合ELISA、免疫层析和免疫比浊等类抗体的制备。

    • 重组蛋白抗原:

         重组蛋白抗原制备常用的有原核表达系统、酵母表达系统、真核表达系统,真核表达系统主要有昆虫细胞-杆状病毒表达和哺乳动物细胞表达系统;这种方式表达制备的抗原一般来说量比较大,并且在构建的时候一般会加上一个融合标签便于下游纯化,常用的标签主要有GST、6*His、Myc、MBP、Flag、Fc等,根据下游对蛋白质的使用需求,如果不需要标签可以切除,如果不切除标签,后期制备的抗体的时候可以用标签蛋白去中和高免血清。重组蛋白与天然蛋白相比较,在构象和修饰和蛋白活性上跟天然提纯蛋白还是有差距的,一般来说真核比原核在蛋白构象和修饰上又进步了一大截,更加接近于天然蛋白;这类抗原制备的抗体一般适合于ELISA、免疫层析和免疫比作抗体的制备,只不过制备的过程中需要用实体标本交付验证。

    福因德科技提供重组蛋白制备服务和重做蛋白制备过程中需要的所有试剂

    • 人工合成抗原:

    人工合成抗原只要用于制备小分子抗体和多肽抗体,这类合成抗原都需要偶联到蛋白质载体上才能形成大分子抗原,常用的蛋白质载体主要有BSA(牛血清白蛋白),RSA(兔血清白蛋白),HSA(人血清白蛋白),OVA(卵清蛋白),GST(谷胱甘肽S转移酶),KLH(Knoweyhole Limpet Hemocyanin,钥孔戚血蓝蛋白),MAP(多价抗原肽,主要指多聚Lys)。小分子抗体直接偶联载体很难连上或者连上之后造成构象变化,所以只有通过合成途径引入一些连接臂或者Liker然后再连接到蛋白质大分子载体上制备出完全抗原;对于多肽来说偶联到载体上很容易,多肽链上的羧基或者氨基通过EDC(碳二亚胺)或者EDC与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)联用将多肽和载体欧联在一起,更为高效的方式是在多肽上加上一个Cys,通过Sulfo-SMCC试剂定向偶联到蛋白质载体上。合成抗原偶联到载体上一般一个载体上偶联10-20个,本身对于抗原表位也是一个富集的过程;人工合成多肽主要应用于那些抗原难以提取液难于通过重组表达来实现的或者是想检测某一特定蛋白,而这个特定蛋白本身与其他蛋白高度同源的。多肽的合成在现代化工上是一个比较成熟的技术,多肽作为抗原主要难点在于多肽的设计(抗原表位的选取)。