抗体的标记——辣根过氧化物酶(HRP)

  • 来源:福因德科技(武汉)有限公司
  • 时间: 2021/3/17
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    抗体可以通过不同的化学试剂交联到酶(辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶)、荧光染料(FITC、PE、APC等)、生物素(Biotin)、胶体金等。抗体标记HRP最为经典的方法为NaIO4氧化法,先将HRP糖基氧化成醛基,醛基与抗体的-NH2反应生成希夫氏碱反应,抗体分子与HRP分子形成稳定结构。标记的时候一般按照抗体分子与HRP分子摩尔比1:4的比例进行标记,此时,两者的质量约为1:1。

    1. 抗体/蛋白的HRP标记(NaIO4氧化法)

    标记以2mg抗体为例。

    1.1 抗体/蛋白的处理

    待标记抗体/蛋白在50mM碳酸盐缓冲液 (0.015M Na2CO3,0.035M NaHCO3,pH9.6) 中透析,其间换液2次,抗体/蛋白浓度调整为2mg/ml;或者将高浓度的抗体用0.5M碳酸盐缓冲液(0.15M Na2CO3,0.35M NaHCO3 ,pH9.6)稀释到2mg/ml,如果原抗体/蛋白溶液中含有Tris、NH4+等游离氨基的试剂,必须透析除去。

    1.2 HRP酶的氧化

    1.2.1 称取2mg HRP干粉(Frdbio)溶于100 μL ddH2O 中。

    1.2.2 称取 NaIO4 21mg,溶于1 mL的ddH2O中,吸取100μL NaIO4溶液与100μL的HRP溶液缓慢混合,4℃下静置 30min,此时溶液为绿色。

    (注意:此后的操作均在避光条件下进行。)

    1.2.3 吸取2μL乙二醇缓慢加入氧化后的HRP溶液,室温避光静置 30min,此时溶液为褐色。

    1.3 抗体的标记

    1.3.1 将氧化好的HRP溶液直接加入到已处理好的抗体/蛋白溶液中,室温反应2h。

    1.3.2 称取0.4mg的NaBH4,溶解于20μL的 ddH2O中,全部加入上步反应液中,4℃静置 2h,每30min摇动一次。

    1.3.3 PBS(pH7.2)透析过夜,标记液中加入体积比30%~50%的甘油,混匀后置于-20℃保存。

    2. 抗体/蛋白的HRP标记(戊二醛法)

    参照多肽与载体偶联相关“三种不同多肽与载体偶联的方式——Frdbio GA(Glutaraldehyde,戊二醛)介导多肽与载体偶联”。