重组蛋白纯化——可溶性蛋白纯化(NI)

  • 来源:福因德科技(武汉)有限公司
  • 时间: 2021/3/31
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    Ni-NTA层析柱亲和纯化组氨酸(6His)标签融合蛋白

    1. 样品制备

    1.1 样品制备1:   细菌或酵母胞内表达的蛋白 

    1.1.1 将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中,8,000rpm,离心15min收集菌体,然后加入1/10体积的裂解缓冲液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM imidazole ,pH 8.0,1mM PMSF) ,加入0.2~0.4mg/ml溶菌酶。

    (PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。)

    1.1.2 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I),混匀,放置于冰上,然后冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。

    1.1.3 将澄清的破碎液转移至离心管中,10,000rpm下,4℃离心20~30min,取上清,置于冰上备用或-20℃保存。

    1.2 样品制备2:  酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白 

    将诱导表达结束的培养物转移到离心管中,8,000rpm,离心15min,收集上清。

    1. 如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质,即可直接上柱使用;

    2. 如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,需先用PBS 4℃下透析才可上柱; 

    3. 大量体积的上清,需加入(NH4)2SO4沉淀浓缩,再用PBS 4℃透析后再上柱子。

    2. 样品纯化

    Ni-NTA亲和树脂灌装层析柱或直接使用预装柱,层析柱下端接核酸蛋白检测仪。

    (所有溶液/样品液使用前建议离心或用0.22μm 或0.45μm滤膜过滤后再上柱。)

    2.1 用3~5倍柱床体积的去离子水冲洗掉层析柱树脂保护液。

    2.2 使用至少5倍柱床体积的裂解缓冲液平衡层析柱。

    2.3 经过滤的样品液上柱,并收集层析柱下端流出的液体(流穿液)。

    利用泵或注射器上样,如果是重力柱也可直接用移液器上样。

    2.4 用洗杂缓冲液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,20 mM imidazole,pH 8.0)冲洗柱子,直到核酸蛋白检测仪数值达到一个稳定的基线;至少需要10~15个柱床体积洗杂缓冲液。

    在裂解缓冲液和洗杂缓冲液中加入低浓度咪唑(imidazole)可以提高纯化蛋白的纯度。

    2.5 用洗脱液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,250 mM imidazole,pH 8.0)采用一步法或线性梯度洗脱液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,20~300 mM imidazole,pH 8.0)梯度洗脱。洗脱的过程中顺次分管接收洗脱蛋白并分别做上标记。

    (一步法洗脱中,通常5倍柱床体积洗脱液可彻底洗脱;梯度洗脱中,通常需要20倍柱床体积或更多洗脱液分离不同结合强度的蛋白质。)

    3. SDS-PAGE检测分析纯化过程各组分

    纯化过程中得到的样品(包括上样前样品液、流穿液、洗杂液和顺次收集的洗脱蛋白)以及原始样品使用SDS-PAGE检测分析纯化效果。

    4. 填料再生与保存

    组氨酸标签蛋白亲和纯化填料所带的Ni2+不需要经常螯合去除和重新挂Ni2+。当填料使用过程中发现反压过高,填料上面出现明显的污染,或者填料载量明显变低时,需要进行对填料进行Ni2+剥离和重新挂Ni2+,也就是填料再生。将填料装填在合适的层析柱内,按照下面操作流程进行Ni2+剥离和重新挂Ni2+。

    4.1 使用0.2 M 醋酸溶液(含 6 M 盐酸胍)清洗2倍柱床体积。

    4.2 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

    4.3 使用2% SDS 清洗3倍柱床体积。

    4.4 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

    4.5 使用乙醇清洗5倍柱床体积。

    4.6 使用去离子水清洗5倍柱床体积。

    4.7 使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗5倍柱床体积。

    4.8 使用去离子水清洗5倍柱床体积。 

    4.9 使用100 mM NiSO4清洗5倍柱床体积。

    4.10 使用去离子水清洗10倍柱床体积。 

    填料再生后,可以立即使用,也可以保存在20%的乙醇中,置于4℃保存。

    5. 填料上残留污染物的去除:建议按照下面操作去除填料上残留的污染物,如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

    5.1 去除强疏水结合的蛋白、脂蛋白和脂类

    通过使用30%异丙醇清洗5~10个柱床体积,接触时间为15-20min可以去除此类污染物。然后,再使用10倍柱床体积的去离子水清洗。也可以选择使用含有去污剂的酸性或碱性溶液,2倍柱床体积清洗填料。例如,含有0.1–0.5% 非离子去污剂的0.1 M 醋酸溶液,接触时间为1~2 h。去污剂处理后,需要使用70%的乙醇清洗5个柱床体积,以彻底去除去污剂。最后使用10倍柱床体积的去离子水清洗。

    5.2 去除离子作用结合的蛋白

    使用1.5M NaCl溶液浸泡柱床填料10~15min后,流出浸泡液,再使用去离子水清洗10个柱床体积。

    6. 问题及解决方案

    问题

    原因分析

    推荐解决方案

    柱子反压过高

    填料被堵塞

    裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上柱前使用滤膜(0.22   or 0.45 μm)过滤,或者离心去除。

    样品中含有高浓度的核酸,加长破碎时间直至粘度降低,或者添加DNase I (终浓度5 μg/ml),Mg2+ (终浓度 1 mM),冰上孵育10-15min。

    样品太粘稠

    有机溶剂或者蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速。

    洗脱组分中没有目的蛋白

    蛋白可能是包涵体,没有在上清中

    可以通过电泳检测裂解液分析上清中是否含有目的蛋白,包涵体蛋白需要按照包涵体蛋白的纯化方式。

    表达量太低

    优化表达条件。

    目的蛋白结合比较弱,在洗杂步骤被洗下来了

    提高洗杂缓冲液的pH,或者降低咪唑浓度。

    目的蛋白结合过强,不容易洗脱下来

    降低洗脱缓冲液r的pH值,或者增加洗脱缓冲液中咪唑浓度。

    使用10~100mM EDTA溶液剥离镍离子,同时得到目的蛋白。

    蛋白降解

    菌体破碎时添加一些蛋白酶抑制剂。在4℃下进行纯化操作。

    洗脱组分不纯(含有多种蛋白)

    洗杂不彻底

    增加洗杂缓冲液体积。

    样品中含有其他的组氨酸标签蛋白

    通过调节pH值,或者咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他的纯化手段(如离子交换,疏水等)进一步纯化洗脱组分。

    填料呈现褐色

    缓冲液中含有DTT等还原剂

    适当降低还原剂DTT的浓度,或者改用巯基乙醇。

    上样过程中蛋白发生沉淀

    操作温度太低

    室温下进行上样。

    蛋白发生聚集

    在样品和所有的缓冲液中添加稳定剂,如0.1%的Triton X-100 或者Tween-20。