单克隆抗体制备——细胞融合

  • 来源:福因德科技(武汉)有限公司
  • 时间: 2021/4/2
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    : 2em;">融合测试优化,融合率高,阳性率高,抗体产量高。

    MCC0012

    50×HT添加剂

    10ml

    杂交瘤融合专用,融合测试验证。

    MCC0013

    50×HAT添加剂

    10ml

    杂交瘤融合专用,融合测试验证。

    MCC0014

    10×Hybridoma   cell Medium supplement

    10×杂交瘤培养基添加剂

    100ml

    杂交瘤融合和细胞亚克过程中添加此添加剂,完美替代饲养细胞功能

    MCC0015

    0.4%台盼蓝(Trypan blue)染液

    10ml/100ml

    细胞染色计数

    MCC0016

    1640培养基

    500ml

    批次稳定,细胞生长状态好。

    MCC0017

    DMEM培养基

    500ml

    批次稳定,细胞生长状态好。

    MCC0018

    链霉素-青霉素

    100ml

    纯度高,细胞毒性小。

     

    ,
    1.实验必备(以下器材/试剂必须全部准备齐全才可以开始操作)

    Frdbio单抗融合器材/试剂准备表

    器械名称

    数量

    备齐打√

    器械名称

    数量

    备齐打√

    细胞培养超净台

    1台


    75%乙醇

    200ml


    水平离心机

    1台


    75%酒精棉球



    倒置相差显微镜

    1台


    1640不完全培养基

    500ml


    血球/细胞计数板

    1块


    胎牛血清

    50ml


    灭菌手套

    5副以上


    50% PEG1450融合剂

    1ml


    灭菌烧杯

    3只以上


    双抗(链霉素和青霉素)

    2ml


    消毒的固定板

    3套以上


    HAT添加剂(50×)

    4ml


    无菌固定针头

    20支


    HT添加剂(50×)

    4ml


    1.5ml/15ml/50ml离心管

    5套以上


    0.4%台朌蓝染色液(PBS)



    排枪及各种规格移液器

    1套以上


    材料名称

    数量

    备齐打√

    各种规格灭菌枪头

    1套以上


    冲击免疫好的Balb/c小鼠

    融合前1~3天冲击免疫,可选小鼠尾静脉或腹腔冲击,不加佐剂;

    1只


    无菌5~10ml注射器

    2个


    灭菌镊子和剪刀

    10把


    无菌止血钳

    2套以上


    空白鼠Balb/c

    用于制备饲养细胞,饲养细胞可以用脾脏也可以用腹腔细胞;

    1只


    灭菌匀浆器

    3套以上


    灭菌细胞筛网

    3把以上


    灭菌加样槽

    5套以上


    SP2/0细胞

    SP2/0细胞获取方法:细胞传代或SP2/0接种到Balb/c小鼠皮下长出的实体瘤,花生米大小为宜。

    1×107左右


    灭菌大滤纸

    5张


    灭菌滤纸条

    20条


    96孔细胞培养板

    10块


    2.试剂配制

    2.1 实验前取PEG1450 1ml于无菌EP管37℃预温;

    2.2 HAT完全培养基:20%胎牛血清+1%双抗(链霉素和青霉素)+1/50体积的HAT(50×)+1640不完全培养基,按每块96孔板20ml配制,于37℃预温;

    2.3 分取50ml 1640不完全培养基37℃预温(融合后稀释PEG用)。

    3.实验前准备工作:

    实验前将实验要用到的离心管、离心管架、剪子、镊子、匀浆器、细胞筛网、培养皿、固定板等放入超净台,紫外照射30min左右。

    4.饲养细胞/融合细胞准备

    4.1 饲养细胞的制备(可在融合前一天完成,亦可当天制备):

    4.1.1 取空白Balb/c小鼠,眼球取血处死,将其浸入75%乙醇中5min,并且用镊子将其夹住在乙醇中不时搅动使其充分消毒。

    4.1.2 将灭过菌的滤纸铺在固定板上(内面朝上),用镊子将老鼠从75%酒精中取出,沥干酒精。

    4.1.3 取无菌固定针头将老鼠侧卧固定(身体左侧向上)在固定板上。

    4.1.4 用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的腹部皮肤,用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子,沿口子将老鼠的皮肤撕开,将其固定(注意:老鼠外侧皮毛不要接触内部)。

    4.1.5 取10ml 1640不完全培养基在干净的灭菌玻璃培养皿里, 10ml注射器吸取5ml培养基,用一个灭菌镊子轻轻提起老鼠的腹膜,将5ml培养基打入老鼠腹部,同时轻轻按摩老鼠的腹部1min后,将培养基回收,置于50ml无菌离心管中,再次吸取5ml培养基,可重复此步骤多次(此步为取腹腔细胞步骤,如不需则省略)。

    4.1.6 取3~5ml 1640不完全培养基放入匀浆器中,用剪刀和镊子,将鼠腹腔剖开,取出其左侧的脾脏剪去表面脂肪,放进匀浆器中轻轻研磨。

    4.1.7将研磨的液体通过细胞筛网过滤掉块状物。

    4.1.8取3~5ml培养基冲洗匀浆器,再次过筛网。

    4.1.9将细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中,若取了腹腔细胞可合并置于50ml无菌离心管中,加1640不完全培养基至30ml,离心1,500rpm,5min,弃上清。

    4.1.10将沉淀重悬于HAT完全培养基,此时饲养细胞已制备好,可按105/孔使用,于融合前一天铺板105个/100μl/孔,亦可当天随融合细胞混合铺板。

    4.2 免疫脾细胞制备:

    4.2.1 取免疫Balb/c小鼠,眼球取血处死,将其浸入75%乙醇中5min,并且用镊子将其夹住在75%乙醇中不时搅动使其充分消毒;

    4.2.2将灭过菌的滤纸铺在固定板上(内面朝上),用将老鼠从75%酒精中取出,沥干酒精。

    4.2.3 取无菌固定针头将老鼠侧卧固定(身体左侧向上)在固定板上。

    4.2.4 用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的腹部皮肤,用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子,沿口子将老鼠的皮肤撕开,将其固定(注意:老鼠外侧皮毛不要接触内部)。

    4.2.5 取3~5ml 1640不完全培养基放入匀浆器中,用剪刀和镊子,将鼠腹腔剖开,取出其左侧的脾脏剪去表面脂肪,放进匀浆器中轻轻研磨。

    4.2.6 将研磨的液体通过细胞筛网过滤掉块状物。

    4.2.7 取3~5ml 1640不完全培养基冲洗匀浆器,再次过筛网。

    4.2.8将细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中,置于50ml无菌离心管中,加1640不完全培养基至30ml,离心1,500rpm,5min,弃上清,1640不完全培养基重悬细胞沉淀,备用。

    4.3 SP2/0细胞制备:

    若SP2/0为培养细胞,直接吹打悬浮起来后离心即可计数使用;若为实体瘤SP2/0,按以下步骤操作:

    4.3.1 取背部花生米大小实体瘤的Balb/c小鼠,眼球取血处死,将其浸入75%乙醇中5min,并且用镊子将其夹住在乙醇中搅动使其充分消毒。

    4.3.2 将灭过菌的滤纸铺在固定板上(内面朝上),用镊子将老鼠从75%酒精中取出,沥干酒精。

    4.3.3 取无菌固定针头将老鼠俯卧固定(身体背侧向上)在固定板上。

    4.3.4 用灭菌镊子轻轻拉起老鼠的背部近尾侧皮肤,用灭菌剪刀从下往上剪开一道口子,沿口子将老鼠的皮肤撕开,将其固定(注意:老鼠外侧皮毛不要接触内部)。

    4.3.5 用镊子和剪刀剪下实体瘤(实体瘤以均匀棕白色,质地松软不液化为宜,液化部分多为死细胞)放入匀浆器中加入3~5ml1640不完全培养基研磨。

    4.3.6 将研磨的液体通过细胞筛网过滤掉块状物。

    4.3.7 取3~5ml 1640不完全培养基冲洗匀浆器,再次过筛网。

    4.3.8 将经过细胞筛网过滤的液体吸入干净的50ml无菌离心管中,加培养基至30ml离心1,500rpm,5min,弃上清,1640不完全培养基重悬细胞沉淀,备用。

    (以上4.1 、4.2 、4.3 三个步骤可以同时进行,融合时细胞离体时间越短其融合效果越好。)

    5.融合操作步骤

    5.1 用1640不完全培养基将SP2/0细胞和免疫鼠脾细胞重悬,分别用血球计数板计数,按脾细胞:SP2/0细胞=1:3比例于50ml无菌离心管中混合,充分混合后加1640不完全培养基至40ml;

    5.2 离心1,500rpm 5min 。

    (此时准备37℃的温水用于细胞融合离心管的温育。)

    5.3 离心后弃上清以及管壁液体(可用灭菌吸水纸条吸干),轻轻敲打SP2/0细胞和免疫鼠细胞混合沉淀使其松动,将离心管底部浸入37℃温水中。

    5.4 从培养箱中取出已温育的1ml融合剂PEG1450,60s内均匀滴入细胞混合沉淀中(边滴加边转动离心管)。

    5.5 静置温育45s,取出37℃温箱中预热的1640不完全培养基,取1ml,60s均匀滴入沉淀中稀释PEG融合剂(边滴加边转动离心管),再取1ml,30s内均匀滴入,之后将剩余的45ml培养基全部慢慢滴入。

    (注意:不要用力冲击!此步骤为稀释融合剂。)

    5.6 轻轻颠倒混匀后,离心1,500rpm 5min,弃上清。

    5.7 用含有饲养细胞和HAT完全培养基溶液200ml重悬细胞沉淀;若饲养细胞已提前铺板,则只需用100ml的HAT完全培养基溶液重悬。

    (饲养细胞是一把双刃剑,可以辅助融合杂交瘤细胞生长,但是对于入门新手来说,如果操作不当除了增加污染的风险外,还可能由于使用量太少达不到辅助作用,或者使用量太大,与融合细胞争夺营养,对融合造成毁灭性破坏。)

    福因德生物通过研究杂交瘤细胞生长的规律,发现对杂交瘤细胞生长促进作用最为显著的是IL-6,EGF等,通过调配这些生长因子的比例和浓度,研发出杂交瘤细胞培养添加剂,使杂交瘤细胞处于最优生长环境,单抗初学者可以选择此产品,使用此产品后无需再添加饲养细胞,细胞融合后长出的细胞集落均匀,细胞孔背景干净。

    货号

    产品名称

    规格

    产品描述

    MCC0010

    杂交瘤融合专用血清

    100ml

    融合率高,10%使用即可,无需添加饲养细胞

    MCC0011

    PEG1450 融合剂

    5×1ml

    融合效率高,对细胞无毒性。

    MCC0022

    SP2/0细胞

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