用于质谱鉴定的蛋白质凝胶样品酶解方法

  • 来源:福因德科技(武汉)有限公司
  • 时间: 2021/4/26
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    用于质谱鉴定的蛋白质凝胶样品酶解方法



    SDS-PAGE蛋白条带酶解方法

    1、用手术刀片切下胶上目标条带(或用自制切点器切下感兴趣的点),置于EP管中(胶块切成约1 mm3大小),同时切下空的胶块作对照。

    2、加入200-400 μL 100 mmol/L NH4HCO3/30%ACN脱色,清洗至透明,去除上清,冻干注:脱色液体积过量为好,脱色至透明,不必担心蛋白质的损失,因为完整蛋白质在此条件下很难被洗脱。

    3、每管加入90 μL 100 mmol/L NH4HCO3,10 μL 100 mmol/L DTT,56 ℃孵化30分钟,还原蛋白质。

    4、去上清,每管加100 μL 100%ACN,5分钟后吸去。

    5、每管加入70 μL 100 mmol/L NH4HCO3,30 μL 200 mmol/L IAA(现配,避光保存),暗处20分钟。

    6、去上清,每管加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3,室温15分钟。

    7、去上清,加入100 μL 100%ACN,5分钟后吸去,冻干。

    8、冻干后,各加入5 μL 2.5-10 ng/μL Trypsin溶液,置于4 ℃冰箱30-60分钟,使胶块充分吸胀(若仍有剩余液,吸出打掉)。

    注:50 ng酶量基于考染一块胶1000 μg的上样量,12.5 ng基于银染一块胶100 μg的上样量。上样量增加,酶量同比增加,酶与被分析蛋白质质量比一般为1:20-1:100。

    9、加入20-30 μL左右25 mmol/L NH4HCO3缓冲液(无Trypsin),pH 7.8-8.0(Promega);

    注:缓冲液体积视胶块体积而定,一般没过胶块20μL左右。

    10、37 ℃反应过夜,20小时左右。

    11、吸出酶解液,转移至新EP管中,原管加入100 μL 60% ACN /0.1%TFA,超声15分钟,吸出溶液,并入前次溶液,冻干。

    12、样品制备完成,复溶(5 μL 0.1%TFA),点样,进行质谱分析。

    双向电泳凝胶蛋白斑点酶解方法

    1. 用合适口径的移液器枪头挖下凝胶上的目标斑点,置于进口EP管中。

    2. 加入200-400 μL 100 mmol/L NH4HCO3/30%ACN脱色,清洗至透明,去除上清,冻干。

    注:脱色液体积过量为好,脱色至透明,不必担心蛋白质的损失,因为完整蛋白质在此条件下很难被洗脱。若为银染,取30-50 μL 30mmol/L K3Fe(CN)6 : 100 mmol/L Na2S2O3=1:1(体积比) 加入胶块内,洗至蛋白质点棕色消失,去除上清,立刻加200 μL水终止反应,10分钟,去除上清,再加入100 μL 100 mmol/L NH4HCO3,静置20分钟,去除上清,冻干。

    3. 冻干后,各加入5 μL 10 ng/μL Trypsin溶液,置于4 ℃冰箱30-60分钟,使胶块充分吸胀,若仍有剩余液,吸出打掉。

    注:一般50 ng酶量基于考染一块胶1 μg的上样量,12.5 ng基于银染一块胶100 μg的上样量,上样量增加,酶量同比增加,酶与被分析蛋白质质量比一般为1:20-1:100。

    4. 再加入20-30 μL左右25 mmol/L NH4HCO3缓冲液(无Trypsin),PH 7.8-8.0 (Promega),注:缓冲液体积视胶块体积而定,一般没过胶块20 μL左右。

    5. 37 ℃反应过夜,20小时左右。

    6. 吸出酶解液,转移至新EP管中,原管加入100 μL 60% ACN /0.1%TFA, 超声15分钟,吸出溶液,并入前次溶液,冻干。

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