文献解读|由EGCG-锌网络构建的ROS响应性微囊 可改善小鼠后肢缺血的治疗性血管生成

  • 来源:北京索莱宝科技有限公司
  • 时间: 2021/5/11
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     近年来,外周动脉疾病(Peripheral arterial disease,PAD)的患病率显著增加,影响了近20%的60岁以上的人群。重症肢体缺血(Criticallimb ischemia,CLI)是PAD发展到晚期出现的严重症状,临床表现为四肢氧气和营养物质长期供应不足。外科手术或介入血管重建术是最有效的治疗方法,但相当多的患者不适合这些治疗。因此,通过毛细血管再生和现有血管外的动脉来使缺血组织血管化的治疗性血管生成已得到广泛的研究。目前,多种生长因子和干细胞已被尝试作为血管生成启动子。但由于其半衰期短、稳定性差、脱靶效应、成本高、对缺血组织有害微环境的无视等问题,限制了其临床应用。因此迫切需要研究一种既能促进血管生成又能改善微环境的有效、安全、经济的方法

    表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)作为绿茶中的主要多酚,具有ROS清除、抗氧化、抗炎等生物活性。因此,EGCG在改善肢体缺血微环境方面具有潜在的应用价值。此外,EGCG也可与金属离子络合形成金属多酚网络(MPNs),由其高度生物相容性和多功能化性引起人们极大关注,一些MPN可用于抗癌药物递送。同时,锌离子具有促进血管生成、细胞增殖和迁移的能力。然而,由于其显著的毒性,其应用受到限制。因此,锌离子的持续和受控释放成为了研究的关键。

    近日,北京协和医院李拥军/杨菁/王晓莉课题组在Bioactive Materials权威杂志发表金属多酚微囊用于后肢缺血治疗的最新研究成果。课题组通过金属-多酚配位的技术,选择具有抗炎、抗氧、改善缺血微环境作用的EGCG和能够与EGCG配位且具有诱导血管生成作用的Zn2+,通过EGCG与Zn2+的配位作用制备了锌基金属EGCG微囊(EGCG/Zn Ps),不仅可以实现Zn2+的持续释放,从而降低毒性,改善血管生成;还可以通过EGCG清除ROS改善微环境。在体外,EGCG/Zn Ps表现出显著的抗氧化、抗炎和诱导细胞迁移作用。在小鼠肢体缺血模型中,EGCG/Zn Ps可以显著促进缺血组织的血管生成和细胞增殖。同时,EGCG/ZnPs组在肢体缺血评分和血流量恢复方面比其他组更为显著。综上所述,EGCG/Zn Ps是一种结合了Zn2+和EGCG优点的安全、有潜力的方法,可以直接应用于肢体缺血的相关治疗研究中

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    基本信息

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    题目:

    ROS-responsive capsules engineered from EGCG-Zinc networks improve therapeutic angiogenesis in mouse limb ischemia

    期刊:Bioactive Materials

    影响因子:8.724

    PMID:32817909 

    第一作者:陈作观博士;段建伟博士

    通讯作者:李拥军教授;杨菁研究员;王晓莉副研究员

    作者单位:北京医院血管外科;中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所

    索莱宝合作产品:

    产品名称

    产品货号

    Phorbol 12-Myristate 13-Acetate

    佛波酯 PMA

    IP1010

     

    摘 要

    有效改善缺血微环境并诱导血管生成是治疗重症肢体缺血疾病的关键。据报道金属锌离子具有促血管生成作用,但剂量过大会对机体产生毒副作用。课题组利用金属多酚配位技术构建Zn-EGCG微囊,发现其可以通过EGCG抗炎、抗氧的特性来改善缺血微环境,同时实现锌离子的缓释减毒及促血管生成作用。研究者测量了Zn-EGCG微囊的表面结构、ζ电位、红外吸收峰和锌离子释放曲线。在体外,Zn-EGCG微囊表现出显著的抗氧化、抗炎和诱导细胞迁移的特性。体外和体内研究表明,Zn-EGCG微囊能够持续释放Zn2+,从而有效降低其毒性作用并诱导血管内皮生长因子的表达。在肢体缺血的小鼠模型中,Zn-EGCG微囊促进缺血组织的血管生成和细胞增殖。与其他组相比,微囊组肢体缺血评分、肢体温度和血流恢复最为明显。总之,Zn-EGCG微囊将Zn2+和EGCG的优点相结合,达到微环境改善及血管生成的协同作用,为制备后肢缺血治疗药物提供了一种很有前景的策略。

     

    研究内容及结果



    1、EGCG-Zn微囊的制备与表征

    本研究以CaCO3为模板,在其表面进行EGCG与锌金属配位形成保护层,然后用EDTA去除CaCO3形成EGCG-Zn配位的微囊载体。通过傅立叶红外光谱、X-射线光电子能谱、动态光散射仪以及扫描电镜等检查提示EGCG-Zn配位后发生了相应的化学键、结合能、电位以及形态的变化,证实了该微囊的成功制备,并实现约48小时的Zn2+缓释效果(图1)。

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    图1

    2、EGCG-Zn微囊的生物相容性和ROS响应性

    研究者通过CCK-8细胞毒性实验证实了锌离子的缓释过程能有效降低其毒性作用,并且EGCG-Zn微囊具有良好的生物相容性。此外,分别采用了H2O2和氧自由基试剂证实了微囊的ROS清除作用,且通过DCFH-DA(2',7'-二氯荧光黄双乙酸盐)ROS分子探针的方法,分别采用共聚焦定性观察,以及流式细胞技术定量分析证实材料的细胞内ROS清除能力(图2)。研究表明,材料的ROS清除能力具有浓度依赖性。

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    图2

    3、体外抗炎、抗氧化和VEGF表达

    通过体外细胞实验分别证实了EGCG-Zn微囊的抑炎、抗氧、促进VEGF表达及促进细胞迁移的生物学功能。采用LPS刺激RAW264.7细胞产生炎症因子,而材料预处理后的RAW264.7细胞,炎症因子(TNF-α,IL-6)表达量明显降低。在细胞毒性浓度的ROS水平下,材料共孵育组可有效的清除过量ROS以减少细胞死亡。此外,在25-50μM浓度时,材料刺激VEGF表达最为明显(图3)。

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    图3

    4、EGCG/Zn Ps对HUVEC迁移具有显著影响

    通过划痕实验确定锌离子刺激细胞迁移而不产生明显细胞毒性的最佳浓度。对于HUVEC:10μM、25μM和50μM浓度的Zn(NO3)2显著增强细胞迁移,而100μM、200μM浓度的Zn(NO3)2则抑制细胞迁移。因此,后续实验均选择锌离子浓度为25μM。在此基础上,探究EGCG、Zn(NO3)2和EGCG/Zn Ps对细胞迁移的影响。PBS(20μL)为空白对照。培养24 h后,接触EGCG-Zn Ps的HUVEC迁移率最高(41.68±2.46%)(P<0.0024;图4);EGCG-Zn Ps(237±23)的HUVEC数量最多(P=0.0003;图4)。

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    图4

    5、EGCG-Zn Ps可有效修复肢体缺血和促进新生血管的形成

    股动脉结扎手术后通过LDPI成像仪评估缺血,所有小鼠的肢体缺血评分在第1天相似。在术后第3、7、14天,PBS组的小鼠后肢坏疽程度最为严重,缺血评分下降较其他组更缓慢(图5A,B)。第14天时,PBS组、EGCG组、Zn(NO3)2组和EGCG/Zn Ps组小鼠缺血评分分别为4±1.41、2.6±0.89、2.5±1和1.33±0.58(P=0.0395);小鼠体重变化分别为−0.12±0.15g、0.32±0.27g、0.77±0.25g和0.99±0.12g(P=0.0014)(图5B,C)。

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    图5

    在第1、3、5、7、10和14天,用LDPI在体内监测肢体血流(图6A)。术前,所有小鼠正常后肢血流量比设置为1.0。第1天,各组缺血肢与正常肢的血流比基本相同。随后,血流比率随时间缓慢恢复,并且EGCG/Zn Ps组小鼠的血流比率恢复更快(图6A,C)。第14天,PBS、EGCG、Zn(NO3)2和EGCG/Zn Ps组的血流比分别为0.772±0.057、0.789±0.048、0.824±0.0185和0.869±0.445(P=0.0003)(图6C)。此外,我们在第14天通过Micro-CTA进一步评估了肢体缺血的血管体积。PBS,EGCG,Zn(NO3)2和EGCG/Zn Ps组的血管体积分别为32.41±1.106、35.17±1.070、40.42±1.149和分别为47.43±0.226(P=0.0156)(图6B,D)。

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    图6

    6、EGCG-Zn微囊促进体内血管生成和细胞增殖

    HE组织肌肉染色表明,在第14天时,对照组的小鼠腓肠肌较微囊组表现出更严重的萎缩。免疫组织学检测指标显示,血小板内皮细胞粘附分子31(Platelet endothelial cell adhesionmolecule-1,CD31)和增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在缺血组织中的表达为正常对照组的3-4倍(图7)。这些结果表明EGCG-Zn微囊可以促进缺血组织中的细胞增殖和组织修复。

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    图7

    7、EGCG-Zn微囊促进体内HIF-1α和VEGF的表达

    除此之外,通过Western及PCR证实了材料能有效诱导VEGF和缺氧反应因子HIF-1α的表达。有报道表明,通过微血管密度这一肿瘤血管生成最主要的量化指标,可预测肿瘤浸润和转移程度。缺氧条件下,HIF-1α被激活并调控VEGF等转录因子参与肿瘤新血管生成。因此,HIF-1α和VEGF可以成为人们研究肿瘤侵袭和转移机制的一个突破口。本研究中VEGF和HIF-1α在缺血组织中的表达显著高于正常对照组,约为2-3倍(图8)。这些结果表明,EGCG-Zn微囊利用Zn2+诱导血管平滑肌细胞的迁移并刺激VEGF和HIF-1α的表达,实现血管新生。

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    图8



     

    研究结论

    本课题组利用金属-多酚配位技术设计制备了一种新型药品递送系统EGCG-Zn微囊,可以更有效地促进血管生成。具有生物相容性的EGCG-Zn微囊不仅可以实现Zn2+的缓释减毒及促血管生成作用,还可以通过清除过量的ROS和利用EGCG抑制炎症细胞因子来改善缺血微环境。该研究将Zn2+和EGCG优点相结合,达到微环境改善及血管生成的协同作用,可作为一种安全、有潜力的治疗和预防CLI的潜在新方法。

     

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    989-51-5

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    没食子酸酯

    ROS

    130405-40-2

    IC0150

    儿茶素

    没食子酸酯

    COX

    970-74-1

    IE0140

    表没食子儿茶素

    MMP

    490-46-0

    IE0120

    表儿茶素

    COX

    1257-08-5

    IE0130

    表儿茶素

    没食子酸酯

    COX

    63223-86-9

    IG0270

    人参皂苷Rh1

    TNF-α

    PPAR

    IL-6

    IL-1β

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    IRAK-1

    TNF-α

    p65

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    乐伐替尼

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    VEGFR

    755037-03-7

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    瑞戈非尼

    VEGFR

    557795-19-4

    IS1320

    舒尼替尼

    VEGFR

     

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