恒温扩增技术系列之环介导LAMP扩增技术

  • 来源:广州美格生物科技有限公司
  • 时间: 2021/7/28
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    恒温扩增技术系列之环介导 LAMP 扩增技术

    什么是 LAMP 扩增技术?

    LAMP 恒温扩增技术的英文名称是:Loop-mediated isothermal amplification, LAMP, 中文名称是:环介导等温扩增反应。

    LAMP 技术的历史

    LAMP  技术是日本学者 Notomi 在 2000 年发明的,他利用特殊的引物设计方法和恒温核酸链置换酶,可以在 60 分钟内,将少量目标 DNA 扩增到千百万份。目前该技术应用已经有超过 20 年的历史。


    图 1.LAMP 扩增反应原理图

    环介导等温核酸扩增反应 LAMP 扩增原理

    LAMP 技术是一种新型的核酸扩增方法,其特点是针对靶基因的 6-8 个区域设计 4-6 种特异引物,进行高度特异性扩增反应。在链置换酶 Bst DNA 聚合酶 (Bst DNA polymerase) 的作用下,与特殊设计的引物形成「环」结构,在 60~65℃ 进行恒温扩增,大约 15~60 min 可实现 10^9~10^10 倍的核酸扩增,具有操作简单。在 DNA 合成的时候,从脱氧核糖核酸三磷酸底物 dNTP 中析出的焦磷酸离子与反应溶液中的镁离子反应,产生了大量的焦磷酸镁沉淀,呈现白色,可以把浑浊度作为反应的指标,只依靠肉眼观察白色浑浊沉淀,就可以鉴定是否有扩增,不需要繁琐的电泳和紫外观察。

    LAMP 引物设计和反应原理如图 1 所,在每一套 LAMP 的引物中,包括两个外部引物:F3 和 B3,两个内部引物:FIP 和 BIP,以及两个环导引物:LOOP F 和 LOOP B。

    LAMP 反应混合物由 dNTPs、引物、DNA 模板、链置换聚合酶 Bst 酶和荧光染料。用于 LAMP 反应的引物设计比较特别。向前内引物 FIP 由 3' 末端的 F2 区和 5' 末端的 F1c 区组成;F3 引物是正向外引物,由 F3 区组成,与模板序列的 F3c 区互补;向后内部引物 BIP 由 3' 末端的 B2 区域和 5' 末端的 B1c 区域构成。向后外引物 B3 引物由 B3 区组成,与模板序列的 B3c 区互补。

    当 FIP 的 F2 区与靶 DNA 的 F2c 区杂交,并启动互补链合成时,开始扩增,然后 F3 引物与靶 DNA 的 F3c 区域杂交,并延伸,取代 FIP 连接的互补链。该置换链在 5' 末端形成环 LOOP,这种在 5' 末端具有环的单链 DNA 用作 BIP 的模板,B2 与模板 DNA 的 B2c 区域杂交,启动 DNA 合成,形成互补链、并打开 5' 末端环,随后,B3 与靶 DNA 的 B3c 区域杂交并延伸,置换 BIP 连接的互补链,这导致形成哑铃形 DNA。通过 Bst DNA 聚合酶将核苷酸添加到 F1 的 3' 末端,其在 5' 末端延伸并打开环,哑铃形 DNA 现在转变为茎环结构。该结构用作 LAMP 循环的引发剂,它是 LAMP 反应的第二阶段。也可以添加环引物用于 LAMP 的指数扩增,获得的最终产品是具有不同茎长度的茎环 DNA 和具有多个环的各种类似于菜花的结构的混合物。

    LAMP 反应温度一般在 65°C,扩增程度小于 250nt。DNA 产物非常长,大于 20KB,由 80–250bp 的短目标序列多次重复形成,与长链共聚体中的单链环区相连。这些产品通常不适合下游操作,但目标扩增非常的多,因此有可能有多种检测模式。采用插层或探针、横向流动和琼脂糖凝胶检测等方法的实时荧光检测均与 LAMP 反应直接兼容。LAMP 设备通常需要加热到所需反应温度,并在需要时实时荧光进行定量测量。


    LAMP 扩增产物的检测方法

    目前,应用比较广泛的 LAMP 检测方法主要有以下几种:
    1. 横向侧流技术:利用横向侧流试纸条进行检测;
    2. 荧光检测:在 LAMP 反应液中加入 SYBR Green Ι ,可以在紫外灯下通过肉眼判定;
    3. 目测或浊度检测:通过对扩增过程中产生的副产物-焦磷酸镁沉淀-来检测判断有无扩增产物;
    4. 凝胶电泳检测:由于扩增后的产物是一系列反向重复的靶序列构成的,是茎环结构和多环花椰菜结构的 DNA 片段混合物, 电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱。

    LAMP 技术的优点
    • 特异性高。针对靶序列的6个区域设计4种特异性引 物,6个区域中如有一处与引物不匹配,就不能进行核酸扩增。

    • 灵敏度高。对某些病原体进行扩增, 模板只要几个拷贝数, 与PCR相比高出几个数量级。

    • 高效、快速。不需要预先的双链DNA的热变性, 反应时间短,30~60分钟就能完成反应,避免了温度循环造成的时间损失。

    • 操作简单。 LAMP扩增反应只需要一个简单的恒温器, 水浴锅、金属 浴均可完成此实验,不需要昂贵的仪器, 可方便操作。

    • 检测LAMP产物方便。 LAMP 在合成 DNA 的过程中会产生大量的焦磷酸根离子, 能与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀, 因此可以根据反应体系中是否生成白色沉淀来判断反应的进行情况。


    环介导等温扩增 LAMP 方法的缺点与局限
    • 容易假阳性。LAMP 扩增技术灵敏度高,一旦开盖就容易形成气溶胶污染,目前国内大多数实验室不能严格分区,假阳性问题比较严重。大量研究推荐使用浊度计等不开盖方法检测扩增产物。 但这些措施并不能在根本上解决假阳性率高的问题,还会存在非特异性扩增。 此类非特异扩增产物的出现与引物序列性质、反应时间的长短有关系, 通过引物筛选、反应时间优化能很大程度上降低其产生几率, 但这会影响 LAMP 技术的可靠性, 限制其在临床的推广。

    • LAMP 引物设计难度较大。LAMP 引物设计要求比较高,对靶序列和引物的长度有很高要求以确保特异性扩增,有些疾病的基因可能不适合使用环介导等温扩增方法。

    • 反应结果只有扩增和不扩增两种, 一旦出现非特异性的扩增, 则不易鉴别。

    • 很难做多重扩增,两三个靶点可以,再多难度就非常大了。

    • 在敏感性上、定量能力上、封闭系统等方面 LAMP 反应不如实时 PCR。


    LAMP 扩增反应的实际应用

    由于环介导等温扩增技术 LAMP 扩增技术使用简便、成本低、灵敏度高,该技术目前已成功地应用于 SARS、禽流感、HIV 等疾病的检测,以及各种细菌、病毒、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口现场快速诊断中。

    产品形式
    LAMP扩增试剂盒2 × LAMP Amplification MixMagigen #F001为预混液形式,只需加入模板和引物即可进行扩增,使用方便。

    申请试用
    拨打020-31607074申请免费测试机会。

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