单细胞悬液制备之血管篇

血管是血液输送养分和营养物质到全身的通道，同时也是新陈代谢过程中代谢废物、残留物和二氧化碳运输的渠道。依运输方向，可将血管分为动脉、静脉和毛细血管。除了毛细血管由单层细胞构成以外，动脉和静脉的血管结构都可以分为三层，它们分别是血管的外膜、中膜和内膜。血管的外膜由疏松结缔组织组成，还有弹性纤维和胶原纤维。血管的中膜也叫中层，位于内膜和外膜之间，主要由结缔组织和平滑肌组成，主要维持血管的舒缩和弹性；内膜是血管的最内层，是三层中最薄的一层，对于维持血管的完整性和预防血栓形成具有重要的意义。

血管的特性源于相互作用的复杂细胞群落，细胞类型的异质性对主动脉血管功能至关重要。单细胞测序可以探索血管的细胞特异性变化，为寻找治疗相关疾病的潜在细胞靶点提供支持。好的悬液制备可以为后期单测数据提供有力的样本支持，临床上常见各种各样的疾病血管类型，针对血管样本吉凯也有特定的消化步骤，还可根据客户的具体需要针对血管组织的特定类型细胞进行分选富集，一起来涨姿势吧！


人血管组织单细胞悬液制备

1. 实验目的
将人血管组织样本分离，制备单细胞悬液，用于后续单细胞测序。

2. 实验准备
样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好相应酶液。

【酶液】：
2mg/ml       collagenase I
1mg/ml        collagenase II
0.04 mg/ml   DNase I
60 U/ml       hyaluronidase
HBSS
【清洗液】：
含0.5% BSA的 PBS

3. 实验步骤
1. 按上述配方配制酶消化液，过滤；
2. 将样本组织倒入培养皿中，放置在冰板上，记录编号，拍照留存，加入清洗液，用清洗液清洗两次；
3. 弃去清洗液后，向培养皿中加入少量消化液，用剪刀将样本组织剪碎；
4. 组织剪碎后，用1ml消化液冲洗剪刀收集转移到合适离心管中，加入适量酶液。    
5. 取20μl消化悬液进行台盼蓝染色镜检。
6. 用封口膜将离心管封好，将样本放置在37oC摇床消化1h；
7. 消化30min时吹打消化液，观察消化效果，发现组织基本消化
8. 消化完后，取20μl消化悬液进行台盼蓝染色镜检。
9. 将消化液通过100μm、40μm滤器转移至50ml离心管内， 300×g 离心5min；
10. 弃去上层液体，加入1ml红细胞裂解液轻柔吹散细胞，静置3min，转移至15ml管中；
11. 加入清洗液至10ml终止裂红，300×g 离心5min；
12．弃去上清，加入清洗液重悬混匀，分别取20μl进行AO/PI计数及台盼蓝镜检，结果反馈。

部分实验结果展示：



样本：人动脉组织
分选后细胞活率：98.31%
活细胞浓度：9.98E+05/ml
结团率：7.02%

 

样本：人肺动脉组织
细胞活率：91.6%
活细胞浓度：3.28E+05/ml
结团率：10.9%


小鼠血管组织单细胞悬液制备

1. 实验目的
将小鼠血管组织样本分离，制备单细胞悬液，用于后续单细胞测序。

2. 实验准备
样本接收，拍照留存，超净台紫外消毒、备好冰盒冰板，准备好相应酶液。

【酶液】：
2U/ml      Liberase
2U /ml     Eletase
10μM       Y-27632
30 U/ml    hyaluronidase
HBSS

【清洗液】：
含0.5% BSA的 PBS

3. 实验步骤
1．按上述配方配制酶消化液，过滤；
2．将样本组织倒入培养皿中，放置在冰板上，记录编号，拍照留存，加入清洗液，用清洗液清洗两次；
3．弃去清洗液后，向培养皿中加入少量消化液，用剪刀将样本组织剪碎；
4．组织剪碎后，用1ml消化液冲洗剪刀收集转移到合适离心管中，加入适量酶液。    
5．取20μl消化悬液进行台盼蓝染色镜检。
6．用封口膜将离心管封好，将样本放置在37oC摇床消化1h；
7．消化30min时吹打消化液，观察消化效果，发现组织基本消化
8．消化完后，取20μl消化悬液进行台盼蓝染色镜检。
9．将消化液通过100μm、40μm滤器转移至50ml离心管内， 300×g 离心5min；
10．弃去上层液体，加入1ml红细胞裂解液轻柔吹散细胞，静置3min，转移至15ml管中；
11．加入清洗液至10ml终止裂红，300×g 离心5min；
12．弃去上清，加入清洗液重悬混匀，分别取20μl进行AO/PI计数及台盼蓝镜检；结果反馈。

部分实验结果展示：



样本：小鼠肺动脉组织
细胞活率：93.2%
活细胞浓度：5.5E+05/ml
结团率：0%



样本：小鼠颈动脉组织
细胞活率：95.28%
活细胞浓度：9.83E+05/ml
结团率：7.22%