最全的空间转录组测序实验总结来了

随着空间转录组测序成为主要的科研手段，小编下面就总结一些我们实操的实验细节，以及项目经验，以供各位老师参考。

新鲜组织的OCT包埋

一、准备工作：干冰（粉末状），OCT（冰上预冷30min以上）

1. 在包埋模具上做好方向标记，用于确定切片方向；
2.在包埋模具中加入1/3或者更多的OCT；
3. 修剪组织，去除组织表面血液或者组织液
4.将组织放入挤有OCT的包埋模具中，调整好位置
5.往包埋模具中继续加入预冷的OCT，完全覆盖组织
6.将包埋模具置于干冰上，盖上干冰盒盖子，或者微敞开放入-80冰箱速冻
7.待组织块变白后，包埋完成，可以连同包埋模具一同保存运输
 

• 骨组织空转一般质检都比较难通过，特别是对于骨龄比较大的样本；
• 即便质检通过，后面切片也不好切，很容易切碎；
• 骨组织贴片的时候也比较容易脱片；
• 对于石蜡骨组织，样本本身可能细胞也比较少，空转捕获到的spot数可能偏少；
• 骨组织石蜡样本除了容易脱片，且因为不确定透化即RNA释放的效果，不能保证探针对RNA的捕获效率，进而导致最后测到的基因数进一步减少。

• 皮肤组织切片不好切且透化困难；
• 皮肤样本因为分层，切片的时候如果纵切，各层暴露的面积太小，如果横切，则很难切除一平层，这个风险需要老师知晓；
• 如果透化过度，细胞内释放的RNA会弥散，进入附近组织区域，比如说老师这个皮肤组织，可能原本应该是真皮层细胞表达的基因，最后检测分析在皮肤的表皮层的角质层有表达，那就没办法解释；
• OCT包埋以后本身组织就是一团了，切的时候就算客户标记好方向，但因为皮肤层的特殊性，也很难完全正好一类细胞横切一层；
• 如果最后透化失败无法继续向下进行实验，老师也要承担前序包括HE染色、切片、RNA质检、透化等费用。

 

• 人的血管样本通常有疾病模型，杂质较多，质检不容易通过；
• 血管如果剪开了平切，容易只切到某一种细胞层；
• （内膜/中膜/外膜），不能包含所有细胞类型；如果纵切；
• 由于血管壁的中空结构，包埋时容易产生空泡；
• 小鼠血管较软，相对不容易包埋，对包埋技术要求较高；
• 基于血管壁的厚度（人动脉直径2.8～3.0cm,厚度约1mm;
• 小鼠动脉直径0.8mm,厚度约0.06mm)，取横截面贴片；
• 血管中间的部分是空白的，只要周围一圈血管壁才能覆盖芯片；
• 对空转芯片捕获区域的利用率相对较低。

• 脊髓一般分离出来是半固态，长条状，如果要做空转，OCT包埋时候需要老师将脊髓平铺包埋并标记号方向，这个有一定难度；
• 我们质检一般切片厚度10um, 脊髓很薄，不好确定脊髓横切面，有找不到老师要的病理区域的风险，可能切不了几刀就切穿了；
• 骨髓也比较软，不太好包埋，可能组织会变形；
• 切片的时候，骨髓容易切碎（连带着骨头一起碎掉，破坏骨髓的组织形态）。

• 需要确定横切还是纵切面，空转一个spot 55μm，点与点之间相距100μm,如果连2个点都覆盖不到，那肯定需要横切；
• 横切的话需要保证在一个平面，如果老师角膜有弧度，包埋需要尽量保证在一个平面；
• 一般小的组织做空转都需要考虑样本的厚度和面积，老师不确定的可以做预实验。