单细胞测序之脾脏篇

脾脏是胚胎时期的造血器官，骨髓造血后，脾脏演变成人体最大的外周免疫器官。脾脏是成熟淋巴细胞定居的场所，其中T细胞占40%, B细胞占60%。90%循环血液流经脾脏，脾脏可以清除血液中衰老的红细胞和血小板，使其得到净化。作为免疫器官，脾脏还是机体细胞免疫和体液免疫的中心，可通过多种机制发挥抗肿瘤作用。单细胞RNA测序是在单个细胞水平上对其含有的转录组信息进行测序分析，是目前分析鉴定免疫细胞亚群异质性的常用方法，可用于鉴定新亚群及分析分化过程中的状态。本文通过展示单细胞测序在脾脏相关领域的研究成果，帮助大家理解脾脏相关免疫细胞异质性及其发育分化过程的调控机制。

案例一
CD8+T细胞组织特异性的转录、表观遗传和适应性图谱

研究目的：利用单细胞测序探索特定的组织环境对TRM细胞分化和动态平衡的作用
样本信息：CD8+TRM细胞（来自小肠、上皮内淋巴细胞、肾脏、肝脏、唾液腺、脂肪组织）以及CD8+记忆细胞（来自脾和血液）
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNA-seq）+ATACseq
捕获细胞数：NA

结论：本研究中，来自不同器官的小鼠CD8+ 组织驻留记忆T细胞（TRM细胞）对病毒感染做出反应的基因表达和基因组可及性的多样性，揭示了共有的及组织特异性的转录和表观遗传特征。肠和唾液腺中的TRM细胞表达转化生长因子(TGF)-β诱导的基因，并由持续的TGF-β信号维持，而脂肪、肾脏和肝脏中的TRM细胞则不表达。构建转录调控网络证实转录抑制因子Hic1是小肠TRM细胞分化的关键调节因子，并表明Hic1过表达促进了TRM细胞的分化并保护其免受感染。该研究为了解CD8+TRM细胞如何适应不同的组织环境提供了一个框架，并确定了介导这些的组织特异性转录调控因子，为在易感染部位增强保护性记忆反应提供了策略。

案例二
单细胞RNA-seq和染色质可及性分析揭示了小鼠γδT细胞的异质性

研究目的：利用单细胞测序探索γδT细胞在组织中的异质性
样本信息：小鼠淋巴结，脾脏和胸腺组织
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNA-seq）
捕获细胞数：11,801个γδT细胞

结论：通过将转录和染色质分析相结合，构建了小鼠淋巴、脾脏和胸腺中γδT细胞的单细胞转录组和染色质可及性景观，揭示了γδT1和γδT17细胞在这些组织中的异质性。在胸腺中，重建了发育轨迹，并在单细胞RNA测序和转座酶可及染色质测序数据的单细胞分析的基础上，进一步深入了解了γδT细胞成熟期、中期和未成熟期的标志基因。值得注意的是，一种新的Gzma γδT细胞亚群被鉴定为不成熟的性质，并且仅局限于胸腺。最后，通过对昼夜节律转录因子（TF）基序富集、调节子富集和NR1D1敲除小鼠进行联合分析，验证了昼夜节律转录因素（TF）NR1D1是γδT17细胞分化的关键负调控因子。

案例三
浆细胞异质性及其长寿亚群对免疫、自身抗原和微生物群的反应

研究目的：利用单细胞测序探索骨髓和脾脏中长寿浆细胞（LLPC）表型和异质性
样本信息：小鼠骨髓和脾脏
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNA-seq）
捕获细胞数：44,189个细胞

结论：通过单细胞mRNA测序、细胞计数和遗传脉冲追踪小鼠模型，发现IgG和IgM LLPC表现出EpCAMCXCR3表型，而IgA LLPC显示Ly6ATigit表型。虽然IgG和IgA LLPC主要由免疫或感染后的体细胞超突变细胞产生，但在IgA和IgM LLPC区隔中发现了具有固有属性和公共抗体的细胞。IgM LLPC高度富集不同个体动物之间共享的公共克隆，以T细胞独立的方式分化，并且对自身抗原和微生物衍生的抗原具有亲和力。

案例四
单细胞染色质可及性测序确定调节性T细胞的组织修复程序

研究目的：利用单细胞测序鉴定在人类健康组织中Treg细胞的特征
样本信息：小鼠脾脏、肺、结肠、皮肤组织，人皮下脂肪、皮肤、血液组织
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNA-seq）+染色质可及性测序（scATACseq）
捕获细胞数：NA

结论：小鼠和人类组织Treg细胞的单细胞染色质可及性特征定义了一种保守的、不依赖于微生物群的组织修复Treg特征，该特征具有转录因子BATF的主要足迹。这一特征，结合基因表达谱和TCR命运图，鉴定了人类外周血中表达BATF、趋化因子受体CCR8和HLA-DR的组织样Treg细胞群。来自正常皮肤和脂肪组织的人BATFCCR8 Treg细胞与非淋巴细胞T滤泡辅助样（Tfh样）细胞具有共同的特征，并且在人Treg细胞中诱导Tfh样分化程序部分再现了组织Treg再生特征。

案例五
单细胞转录组分析揭示中性粒细胞在稳态和感染中的异质性

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                

研究目的：通过单细胞测序探索中性粒细胞功能及其异质性的分子基础
样本信息：小鼠骨髓、外周血、脾脏 中的 Gr1+ 细胞
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNAseq）
捕获细胞数：≥25,000个细胞

结论：通过单细胞测序分析了超过25000个分化和成熟的小鼠中性粒细胞，提供中性粒细胞在稳态和细菌感染期间成熟、功能和命运决定的综合转录图谱。鉴定出8个亚群，3个成熟的外周血中性粒细胞亚群来自不同的成熟骨髓中性粒细胞亚群。在已知和未表征的转录因子的驱动下，中性粒细胞逐渐获得杀死微生物能力，代表了一种对有效但平衡的中性粒细胞反应进行微调调节的进化机制。细菌感染对中性粒细胞群的遗传结构进行重新编程，改变亚群之间的动态转变，并在不影响整体异质性的情况下启动中性粒细胞以增强功能。总之，这些数据为在单细胞分辨率下研究中性粒细胞相关疾病机制、生物标志物和治疗靶点建立了参考模型和一般框架。

案例六
单细胞测序揭示记忆CD8+T细胞的早期前体及其分子决定因素

研究目的：利用单细胞测序探索组织驻留记忆T细胞（Trm）亚群的异质性及其早期前体细胞亚群功能鉴定
样本信息：小鼠CD8+T细胞（小肠IEL与脾脏）
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNA-seq）
捕获细胞数：约2000个细胞

结论：在对微生物感染的免疫应答过程中，CD8+T细胞产生了不同类型的细胞亚群，这些亚群协调介导病原体的清除，并对再感染提供持久的保护，包括非循环组织常驻记忆T细胞的亚群介导非淋巴组织内的有效保护。本文使用单细胞RNA测序检测脾脏和小肠上皮内淋巴细胞(siIEL)室中单个CD8+ T细胞在病毒感染反应分化过程中的基因表达模式，揭示了先前未知的siIEL CD8 T+细胞群在分化的几个阶段的转录异质性，代表了感染早期组织内功能不同的T细胞亚群和T细胞前体亚群。这些发现可能为优化CD8+T细胞反应以防止微生物感染和癌症提供策略。

案例七
无创超声刺激脾脏治疗炎性关节炎

研究目的：利用单细胞测序揭示T细胞和B细胞群体在抗炎途径中的重要性
样本信息：小鼠脾脏
测序策略：10x平台，单细胞测序（scRNA-seq）
捕获细胞数：约25,000个细胞

结论：在炎症性关节炎小鼠模型中，针对脾脏的每日无创超声（US）刺激显著降低了疾病的严重程度。只有在特定参数下才能观察到改善，其中US可以提供保护和治疗效果。脾细胞的单细胞RNA测序和遗传免疫缺陷小鼠的实验揭示了T细胞和B细胞群体在抗炎途径中的重要性。这些发现证明了超声刺激脾脏治疗炎症性疾病的潜力。