mRNA加帽率检测伴侣——RNase H

3月22日，石药集团新冠mRNA疫苗的获批，极大地振奋了国内mRNA行业人的信心，mRNA疫苗在国内落地对整个领域的发展具有重要意义。随着mRNA的不断发展，国内外针对其质量控制的要求也越来越严格，产品开发终端的质量控制研究方法也越来越完善。为规范和指导mRNA质量，早在2020年，中国药监局就发布了《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则（试行）》，用以指导mRNA疫苗的生产和质控。2022年2月23日美国药典（USP）也发布了关于“mRNA疫苗质量分析方法”的指南草案。同年5月我国药监局发布了《体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则（试行）》用于强化mRNA类药品的质量标准。这些指导原则明确对mRNA不同区域结构的完整性提出要求，如5‘-Cap帽或帽类似物结构、poly(A)长度及分布等。

 

 

在体外转录获得的mRNA中，加帽反应可分为两种方式：1）转录后酶法加帽；2）共转录加帽。酶法加帽是利用加帽酶（Cat.No.:GMP-M062, Novoprotein）及2’-O-甲基转移酶（Cat.No.:GMP-M072, Novoprotein）的共同作用完成Cap1的修饰。共转录加帽是利用化学合成的帽类似物，在体外转录的过程中，将帽结构添加到mRNA的5’端。

 

 

图1：mRNA的帽结构是由一个7-甲基鸟苷通过一个5′–5′三***桥连接到mRNA 链的5′核苷上组成。Cap-0结构由相邻的RNA链通过三种酶的依次反应形成。进一步形成cap-1结构需要2’-O-甲基转移酶的参与，该修饰可以降低RNA在体内引起的细胞先天免疫反应。本图引自Decroly, E., Ferron, F., Lescar, J. et al. (2012). Conventional and unconventional mechanisms for capping viral mRNA. Nat Rev Microbiol 10, 51–65。

 

 

无论哪种加帽方式，最终获得的mRNA都必须进行加帽率的检测。比较经典的加帽率检测方式是2016年由诺华生物医学研究所发表在Anal Bioanal Chem杂志的一篇文章“Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS“，文章中使用一种特殊裂解探针法进行mRNA加帽率分析。通过设计mRNA 5’端互补探针，退火形成RNA/DNA杂合链，利用RNase H在特定位置从mRNA的5'末端切割短序列，并用液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）分析获得加帽率。

 

 

图2：加帽率检测原理

 

 

近岸蛋白研发生产的Thermostable RNase H来源于极端嗜热菌Thermus thermophilus,能够在高温的条件下特异性地水解杂交到DNA链上的RNA的磷酸二酯键，故能降解DNA/RNA杂合链中的RNA，而并不消化单链或者双链的DNA。Thermostable RNase H在65℃也能表现出活性，这种特性让该酶能够用于高温实验。近岸蛋白Thermostable RNase H（Cat.No.:E134）经上百例加帽率检测项目验证，可有效酶切获取mRNA 5’端序列，通过LC-MS分析加帽信息。

 

 

案例分析：

 

mRNA样品处理：

 

将以上混合物混匀后置于PCR仪中，50℃反应45min。

 

 

裂解产物经纯化后上机检测：

 

通过以上检测，根据理论分子量在LC-MS结果中匹配对应的Uncapped triphos、Diphos 、G Cap、Cap0、 Cap1成分并计算峰面积占比。

Cap1加帽率=Cap1峰面积占比，Cap加帽率=Cap0峰面积占比+Cap1峰面积占比。

 

 

结果示例：

 

mRNA Cap1加帽效率为97.25% ,Cap0+Cap1 加帽效率为98.81%。

 

 

 

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