抗体的纯化——抗原配体特异性纯化

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2022/5/26
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    抗体的纯化——抗原配体特异性纯化



    1. 抗原(抗体/蛋白)特异性亲和柱制备

    1.1 含氨基配体特异性亲和柱的制备

    1.1.1 称取0.3 g溴化*活化的琼脂糖凝胶(CNBr-activated Sepharose 4B)干粉加入1mM盐酸中,常温搅拌至少30min或者4℃过夜使其充分溶涨,0.3g可以获得1ml溶涨胶。也可直接取1ml NHS活化的琼脂糖凝胶。

    1..12 将凝胶转移入纯化柱中,用约30ml 1mM的HCl抽滤介质3次。抽滤去除内部空气气泡。

    1.1.3 用5~10倍体积的超纯水清洗介质一遍,(留1~2倍体积超纯水将凝胶重悬起来)。

    1.1.4 将含氨基待偶联抗原/蛋白用偶联缓冲液(0.5M NaCl,0.1M NaHCO3,pH8.3)溶解成2mg/ml浓度。

    1.1.5 将重悬的凝胶与待偶联抗原/蛋白-偶联缓冲液迅速混合,室温(25℃)反应2h以上,期间不断摇动,使其充分偶联反应;

    1.1.6 偶联结束,取上清液检测是否还有游离未偶联的配体(蛋白或抗体),检测方法:用分光光度计直接检测计算,如果溶液中配体含量>0.2mg/mL,说明偶联饱和;否则重复第1.1.4~第1.1.5)步。一般1ml凝胶可以偶联10mg抗体/蛋白配体。

    1.1.7 确认偶联完全后,取 15ml封闭缓冲液(1M 乙醇胺,0.5M NaCl,pH8.3或0.1M Tris-Cl,pH8.5)室温(25℃)孵育2h或4 ℃过夜;

    1.1.8 交替使用20ml的偶联缓冲液和20ml的乙酸盐缓冲液(0.5M NaCl,0.1M HAc-NaAc,pH4)洗凝胶柱4次;

    1.1.9 亲和柱制备好后,用PBS平衡后即可用于抗体纯化;

    1.1.10 如若暂不使用,用20%的乙醇(含20% 乙醇,0.02% NaN3的PBS)保存。

    1.2 含巯基抗原/多肽特异性亲和柱的制备

    1.2.1 取适量Sulfolink Beads去掉保护剂,用3倍柱床体积的偶联缓冲液(50Mm Tris,5mM EDTA-Na,pH8.5)洗涤柱子3次。

    1.2.2 将含巯基抗原/多肽用偶联缓冲液溶解成2mg/ml,加入Sulfolink Beads,室温(25℃)摇晃孵育2h。

    1.2.3 去除步骤1.2.2中的缓冲液,收集检测;用3倍柱床体积的偶联缓冲液清洗柱床。

    1.2.4 加入等体积的封闭液(50mM Tris-HCl,5mM EDTA-Na,50Mm L-半胱氨酸,Ph8.5), 室温(25℃)孵育2h。

    1.2.5 柱子用3倍体积的PBS(pH7.4)洗涤3次,可立即使用;如暂不用,可以保存在20%的乙醇(含20% 乙醇,0.02% NaN3的PBS)中。

    货号

    产品名称

    规格

    产品特点与应用

    IGP0041

    Frdbio   CNBr-activated Sepharose 4B

    15g

    与-NH2偶联,最高10mg蛋白/ml凝胶

    IGP0042

    Frdbio   NHS-activated Beads 4FF

    25ml/100ml/500ml

    与-NH2偶联,最高10mg蛋白/ml凝胶

    IGP0050

    Frdbio   Sulfolink Beads 4FF

    25ml/100ml/500ml

    与-SH偶联,最高10mg蛋白/ml凝胶

    2. 抗原(抗体/蛋白)特异性亲和纯化抗体

    其纯化步骤与Protein A /Protein G/ Protein L亲和纯化方法相同。