HABA分析法测算生物素标记效率

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2022/6/8
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    生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law),又称比尔定律或比耳定律(Beer's law),是分光光度法的基本定律,即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度(absorbance,A)与吸光物质的浓度consenreationC)及吸收层厚度(lengthL)成正比用公式表示为:A = ε*C* L其中A为光度,ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为500= ε500 C L(此处ε500=34,000M-1cm-1

    Frdbio HABA分析法测算生物素标记效率试剂盒(ARL0021T1为例,

     

    试剂盒组分:

    1.HABA溶液:             1ml    10mM in 0.01M NaOH

    2.超纯亲和素(Avidin)     10mg

    3.PBS(pH7.2)               30ml     100mM 磷酸钠,150mM NaCl

     

    实验前准备:

    HABA- Avidin混合液配制:5mg Avidin和300uL 10mM HABA加入到9.7ml PBS溶液中,(合格标准:1cm比色皿A500=0.9 ~ 1.3,)配置好的混合液可以在4℃保存,2周内可以正常使用,如果发现有沉淀或者絮状物,请过滤或者离心后使用。

     

    实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法:

    分光光度法:

    A. 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);最好测量三次取平均值;

    B. 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);最好测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)<0.35,请稀释待测样品,再次重复此步骤。

     

    微孔酶标板法:

    A.     取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);最好测量三次取平均值;

    B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),震荡或移液器吹打充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);最好测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)< 0.3*A500(H-A),请稀释待测样品,再次重复此步骤。

     

    标记效率计算方法:

    image.png

     

    标记摩尔比计算:

    生物素:蛋白=[(生物素摩尔浓度*10)/蛋白原始摩尔浓度]*稀释倍数

    *本试剂仅供实验室研究使用*

     

     

    案例演示:

    Frdbio超级生物标记试剂盒(货号:ARL0021SK)标记Anti-Covid-19 Spike Mab (货号:nCoV-S-hMab-B),标记后测算标记比,分光光度计法。

    本案例中被标记蛋白为抗体,分子量(MW)为150,000,浓度为5.0mg/mL,A500(H-A)=1.090,A500(H-A-BP)=0.585,

    抗体摩尔浓度计算:mM /mL=5/150000=3.33*10-5

    ΔA500=(0.9*1.090)- 0.585=0.396

    生物素摩尔浓度计算:mM /mL=0.396/(34000*1)=1.16*10-5

    抗体:生物素(摩尔比)=(3.33*10-5)/(1.16*10-5*10)=1:3.48