重组蛋白纯化——NI亲和层析柱纯化包涵体

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2022/6/21
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    1. 样品制备:包涵体蛋白样品

    1.1 将诱导表达结束后的培养物转移到离心管中,8,000rpm,离心15min收集菌体,然后加入1/10体积的裂解缓冲液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM imidazole pH 8.0,1mM PMSF) ,加入0.2~0.4mg/ml溶菌酶。

    (PMSF很容易降解,在破菌前加入,同时还可加入不影响目的蛋白与树脂结合的蛋白酶抑制剂。)

    1.2 将菌体沉淀悬浮起来(如果菌液浓度高,也可考虑加入10μg/ml RNase A和5μg/ml DNase I),混匀,放置于冰上,然后冰上超声破碎细胞。

    1.3 将破碎液转移至离心管中,10,000rpm,4℃离心20~30min,去掉上清,沉淀为包涵体。

    1.4 步骤1.2和1.3可以重复一次。

    1.5 按照原菌体:包涵体溶解缓冲液(50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl,10 mM imidazole,8M尿素,pH 8.0)=1:10(W/V)将包涵体悬浮溶解,此为包涵体溶液。

    (包涵体溶液可用于变性条件下His标签蛋白的纯化。)

    2. 样品纯化

    纯化方法与“重组蛋白的纯化——可溶性蛋白纯化(NI)”里介绍的His标签融合蛋白Ni-NTA的纯化方法完全相同,不同点在于纯化过程所有溶液都在上述实验基础上都添加8M尿素。