miRNA治疗2型糖尿病新策略!揭示胰岛β细胞中miR-21调控胰岛功能的作用和机制

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2022/9/22 17:39:00
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    2型糖尿病(type 2 diabetesT2D)一种常见的糖尿病类型,其发病特征通常包括GSIS(葡萄糖刺激的胰岛素分泌)β细胞缺陷、糖耐异常、胰岛素抵抗以及高血糖。胰腺β细胞分泌胰岛素对血糖稳态维持至关重要,研究发现,胰腺β细胞功能障碍在T2D发病机制中起重要作用。MiR-21已被证明在葡萄糖不耐受患者和T2D小鼠胰岛中高表达,然而miR-21在胰腺β细胞功能调控中的作用仍不明确。

     

     

    近期,山东第一医科大学附属眼科研究所阮庆国研究员/史伟云教授研究团队在Nature Communications期刊(IF=17.694)发表了题为“MicroRNA-21 Promotes Pancreatic β cell Function through Modulating Glucose Uptake”的研究文章。研究发现胰岛β细胞中的miR-21促进胰岛素分泌,并揭示了miR-21在2型糖尿病中调节胰腺β细胞功能的作用机制,为未来临床预防和治疗2型糖尿病提供了新的手段和策略。


     

    文章所用腺病毒载体

    由维真生物助力提供

     

    病毒产品

    Ad-CMV-Glut2(mouse)

    Ad-CMV-miR-21(human)

    Ad-insulin 1-miR-21(mouse)

    病毒总量

    1×10E8 pfu

    感染细胞

    胰岛细胞

    检测时间

    感染后36-60h共聚焦检测


    腺病毒感染小鼠胰岛细胞效果图

     

     

     

     

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    研究思路


     

     

     

    首先,本研究利用胰岛β细胞miR-21条件敲除(miR-21β KO)小鼠阐明了胰岛β细胞中的miR-21通过调控葡萄糖摄取从而促进胰岛素分泌,并进一步揭示miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1-Glut2信号通路促进胰岛素分泌的分子机制。在此基础上,通过体外实验证实在小鼠和人的胰岛中过表达miR-21可以显著增加胰岛素分泌,并通过体内实验证实将miR-21特异性导入2型糖尿病小鼠的胰腺中可显著降低血糖水平。 

     

     

     

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    部分研究结果分享

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    miR-21基因缺失导致葡萄糖刺激的胰岛素分泌受损

    为研究miR-21在调节胰腺β细胞功能中的作用,研究者从野生型(WT)和miR-21缺(miR-21KO)小鼠中分离胰岛,并在葡萄糖存在的情况下对其进行体外培养,发现用高浓度16.7 mM葡萄糖处理时,miR-21KO小鼠胰岛素分泌显著降低。接下来,研究人员构建了胰腺β细胞特异性缺失miR-21(miR-21βKO)小鼠,腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT)数据显示3、7、10和27周龄 miR-21βKO小鼠糖耐量明显受损,并且miR-21βKO小鼠葡萄糖不耐受伴随葡萄糖负荷后血清胰岛素浓度的降低;体外GSIS实验进一步表征miR-21βKO小鼠胰岛素分泌功能下降。在miR-21βKO小鼠中进行miR-21回补表达则可有效恢复小鼠胰岛葡萄糖刺激的胰岛素分泌。最后,高脂喂养后miR-21βKO小鼠的胰岛对葡萄糖刺激也表现出受损反应。上述实验结果表明miR-21促进胰岛β细胞中的胰岛素分泌,其缺失会损害胰岛素分泌

     

     

     


    图1.胰腺β细胞特异性缺失miR-21小鼠糖耐量和胰岛素分泌受损 

     

     

     

    2

    miR-21βKO小鼠胰岛中参与胰岛素分泌的细胞通路受损

    胰岛素释放的主要机制是GSIS葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白( Glut )转运进入胰腺β细胞糖代谢产生的ATP抑制ATP敏感的K+通道,促进Ca2+内流Ca2+升高可引起胰岛素释放从而使其浓度升高。为了探讨miR-21促进胰岛素分泌的机制,研究人员对WT和miR-21βKO小鼠胰岛进行了mRNA测序分析。GO富集分析发现miR-21βKO小鼠胰岛中参与胰岛素分泌的细胞通路受损,并通过生信分析和Ago2免疫共沉淀等进一步确定了Pdcd4和Pten为miR-21的功能靶标。

    图2.WT和miR-21βKO小鼠胰岛的转录组学分析


     

     

     

    3

    miR-21βKO小鼠胰岛葡萄糖摄取受损

    为确定miR-21缺失影响的特定通路,研究人员首先检测了高K+引起的胰岛素分泌,结果显示,30 mM KCL处理WT和miR21βKO小鼠的胰岛产生了等量胰岛素,表明miR-21并没有通过作用于胰岛素囊泡外泌水平来增强胰岛素分泌。接下来,检测了糖代谢关键中间体葡萄糖6-磷酸( G6P )的产生,结果表明,高浓度葡萄糖作用下,miR-21βKO小鼠胰岛产生的G6P明显减少。通过检测胰岛暴露于葡萄糖时的耗氧量(OCR), 发现miR-21βKO小鼠胰岛对葡萄糖添加的反应明显降低。通过葡萄糖摄取实验,进一步证明miR-21βKO小鼠胰岛葡萄糖代谢降低是由于葡萄糖摄取受损导致。

    图3.miR-21βKO小鼠的胰岛葡萄糖摄取受损


     

     

     

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    miR-21通过上调Glut2表达促进胰岛素分泌

    Glut蛋白属于跨膜蛋白,可以促进葡萄糖跨质膜的运输。为确定miR-21促进葡萄糖摄取的途径,研究者检测了体外葡萄糖刺激下WT和miR-21βKO小鼠胰岛中5种重要Gluts的mRNA表达,结果发现Glut2在WT小鼠胰岛中表达量最高,而在miR-21βKO小鼠胰岛中表达量明显下调。通过免疫荧光染和WB进一步证实了Glut2蛋白在miR-21βKO胰岛中表达降低。
    为确定Glut2表达降低是否是miR-21βKO小鼠胰岛中胰岛素分泌受损的原因,研究人员利用腺病毒介导Glut2在小鼠胰岛过表达,并取得了高效的感染效率同时WT和miR-21βKO小鼠胰岛在腺病毒介导Glut2过表达后细胞凋亡无明显差异。更重要的是,miR-21βKO胰岛中Glut2的异位表达导致Glut2 mRNA水平完全恢复,并挽救了高浓度葡萄糖作用下的胰岛素分泌。综上表明,miR-21通过上调Glut2表达来促进胰岛素分泌。

    图4.miR-21通过上调Glut2表达促进胰岛素分泌

     

     

     

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    miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1通路促进Glut2表达

    既往研究表明,AP-1与Glut2的启动子结合,正向调节Glut2的表达。另一方面,程序性细胞死亡因子4 ( programmed cell death 4,Pdcd4 )是miR-21的靶基因,AP-1活性的负调控因子。为了研究miR-21如何调控Glut2的表达,研究人员检测了miR-21βKO小鼠胰岛中Pdcd4和AP-1的表达,发现miR-21βKO小鼠胰岛中Pdcd4的mRNA和蛋白水平均增加,AP-1亚基c-Jun表达显著降低。进一步研究发现在有效敲除Pdcd4表达的同时,Glut2蛋白水平显著升高,并且体外实验也证明了AP-1活性的改变可以影响胰腺β细胞中Glut的表达。这些数据表明,胰腺β细胞中miR-21可能通过miR-21-Pdcd4-AP-1-Glut2通路促进Glut2的表达。

    图5.miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1通路促进Glut2表达

     

     

     

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    在2型糖尿病小鼠胰腺中过表达miR-21可降低血糖水平

    确定了miR-21是胰岛β细胞胰岛素分泌的正调节因子后,接下来研究人员探究了提高miR-21的水平是否可以改善胰岛素分泌从而降低血糖水平首先,利用腺病毒介导了体外胰岛中miR-21的高表达,结果发现小鼠胰岛过表达miR-21后,miR-21水平和Glut2 mRNA表达明显升高。更重要的是,腺病毒介导的miR-21升高显著增加了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此外,研究发现,在小鼠insulin-1启动子控制下,腺病毒介导的小鼠胰岛中miR-21的过表达也增加了Glut2 mRNA的表达和葡萄糖刺激的胰岛素分泌。
    最后,研究人员利用miR-21 agomir在2型糖尿病db/db小鼠体内提高胰腺中miR-21水平,进一步证实miR-21过表达能够促进Glut2表达和胰岛素分泌,从而显著降低血糖水平。

    图6.胰岛中miR-21过表达可促进Glut2表达和胰岛素分泌


     

     

     

    03

    总结


     

     

     

    综上,本研究证明了胰岛β细胞中的miR-21促进胰岛素分泌,并进一步揭示miR-21通过miR-21-Pdcd4-AP-1-Glut2信号通路促进胰岛素分泌的分子机制,加深了对miR-21在调节胰腺β细胞功能和T2D发展中作用的理解,为2型糖尿病的预防和治疗提供了新思路。

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