重组表达质粒的构建——重组质粒的筛选鉴定

  • 来源:生物谷
  • 时间: 2022/11/9
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    外源片段插入质粒载体之后,必须经过筛选鉴定才能确认外源基因插入是否与当初设计的方案一致。常用的筛选方法有蓝白斑筛选、酶切、PCR鉴定等,最终通过测序确认;表达载体的构建,必须保证插入序列完全正确(不能有碱基丢失、多余、突变)。

    1. 酶切鉴定

    根据事先构建方案的设计信息,选取两个特定位点对重组质粒进行酶切,如果切断序列电泳条带谱与预期一致,说明构建成功。制定酶切方案一定要充分考虑所选酶切位点位置/个数以及切断后所产生片段的情况,不同片段大小是否可以通过电泳分开;如果选用不确定插入方向的克隆策略,通过载体酶切位点和插入序列内部酶切位点结合使用,双酶切结果分析确定核酸序列是否插入以及插入方向。

    2. PCR鉴定

    PCR鉴定是用特异性引物扩增含目的片段的基因,比较合理的设计方案是:选取载体上的一个引物和插入序列的一个引物(下图B),扩增出的片段大小应该是载体引物到结合位点的长度加上外源片段,很多人喜欢直接用外源片段上的两个引物扩增(下图C),这种方法会有很多的假阳性,因为在连接转化过程中可能会有很多的外源片段残留在待测样品中;也有研究者选用载体上跨插入位点的两个引物(下图A),这种方法对于定向克隆是完全可以的。


    基因重组克隆到载体质粒上之后,必须测序验证序列正确性,酶切鉴定和PCR鉴定只能判断片段是否插入,不能确认是否有碱基突变、碱基丢失或是碱基增加。

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